MCM5基因的隆和真核表达及其与P53相互作用的鉴定.pdfVIP

摘 要 摘 要 P53 曾被称为“cellular gatekeeper” (Levine, 1997)和“the guardian of the genome ” (Lane, 1992) , 因为它在协调和整合细胞对多种外界胁迫因子的应答 过程中发挥了重要作用。P53 像一个负责处理和整合信息然后发号施令的枢纽 和控制中心，根据细胞面临的胁迫刺激的种类和刺激强度的差异，启动不同的 下游信号通路，从而决定细胞的应答方式，即细胞凋亡，细胞周期阻滞，细胞 衰老，DNA 损伤修复，细胞代谢状态改变或发生自噬。 不同的胁迫刺激条件可以使 p53 发生不同形式的翻译后修饰变化，进而引 起一系列的细胞应答反应。P53 蛋白包括了 N 端（氨基端）富含脯氨酸的转录 激活结构域，DNA 结合结构域，四聚化结构域和 C 端（羧基端）结构域。P53 应答多种胁迫条件而进行的翻译后修饰主要发生在 p53 蛋白分子的 N 端。虽然 p53 的某些生物学效应与转录功能无关，但 p53 对其靶基因的转录激活是细胞 应答各种胁迫刺激的一种非常重要的方式。而 p53 蛋白的氨基端不仅与其转录 激活有关，还参与了 p53 与 MDM2 的相互作用。除 MDM2 外，还有很多 p53 相互作用蛋白都可以影响 p53 的稳定性。 为了寻找新的可能调节 p53 转录激活的蛋白，我们利用包含了人源 p53 蛋 白氨基端 60 个氨基酸的融合蛋白 GST-p53N60 与 HeLa 细胞裂解液进行 GST pull-down 实验，通过质谱分析获得了一个新的 p53 结合蛋白 MCM5 。MCM5 作为一个 DNA 复制调控蛋白，它是进化保守的真核细胞微小染色体维持蛋白 （minichromosome maintainance ）家族成员之一。这个家族蛋白（MCM2-7 ）可 以形成一个环形异源六聚体复合物，作为 DNA 解旋酶参与 DNA 复制的起始 和延伸过程。我们以 HeLa 的 cDNA 文库作为模板进行 PCR ，获得了全长的人 源 MCM5 基因。并将其克隆到了 pEGFP-C1 和 p3*flag-myc-CMV-24 两个真核 系统表达载体，并通过 GST pull-down 和免疫共沉淀实验进一步确证了 p53 可 以和MCM2-7 解旋酶复合物的调节亚基之一 MCM5 发生相互作用。 关键词：p53 MCM5 质谱分析 蛋白质-蛋白质相互作用 GST pull-down 免疫共沉淀 I Abstract ABSTRACT P53, a forever intriguing and mysterious character on the stage of cell life, has long been known as “cellular gatekeeper” or “guardian of the genome” for its pivotal roles in coordinating and integrating the cellular responses to a variety of external stress stimuli. P53 serves as a node to analyze and response to different kinds and levels of stress by initiating various downstream signaling pathways, such as apop- -tosis, cell cycle arr