KATP通道的活对多巴胺能细胞铁转运功能的影响及其在PD中的作用研究.pdfVIP

ATP敏感性钾通道的激活对多巴胺能细胞铁转运功麓的影响 及其在帕金森病中的作用研究 摘 要 铁是一切生命体都必不可少的微量金属元素之一，体内铁稳态的维持对于机体的 正常生理功能是必需的。但是，过量的铁却可以通过Fcnton反应与体内H202作用， 产生具有高度活性的羟自由基(hydroxyl，·OH)，后者作用予蛋白质、核酸和含有大 量未饱和脂肪酸的细胞膜，从而弓|起细胞损伤。近年来的研究发现，帕金森病 (Parkinson’S disease，PD)病人脑内黑质(substantia nigra,SN)铁含量显著增高。PD 是一种常见的神经系统退行性疾病，其病理特征是中脑黑质致密带(substantia nigra pars 体的DA减少，萼|起静止性震颤，肌僵蛊，姿势反射障碍等临床表现。PD的发病机 制至今仍不是十分清楚，可能与遗传、环境、氧化应激、炎症反应、SN内铁聚集以 及细胞凋亡等多种因素有关。由于铁的细胞毒性以及产生自由基的能力，铁的选择性 聚集成为SNDA能神经元变性死亡的一个关键因素。 在脑内，DA能神经元聚集的部位主要存在子SN，馥侧被盖区(ventral tegmental area,VTA)和弓状核(arcuate 损伤，而VTA的DA能神经元却几乎不受影响，其枫制到目前为止还不是十分清楚。 2005年发表在NatureNeuroscience上的研究表明，SNDA能神经元的选择性损伤的 机制可能与SN区ATP敏感性钾避道(ATP．sensitivechannels，KAa碧)的选择 potassium 性激活有关。细脆内ATP水平的降低或氧化应激等均可导致KArl,通道的激活，引起 细胞膜的超极化。本实验室的前期工作与其他研究者的王作已经证实了二价金属离子 metal 转运蛋臼l(divalem l，DMTl)在PDSN铁聚集中的重要作用。而 transpotter DMTl的铁摄取功能除与蛋囱质的表达量有关夕}，还依赖于州值，温度，膜电位水 平等，如细胞膜的超极化可以增强DMTl的摄铁功能。但是KArl,通道的激活导致的 细胞膜的超极化在DMTl介导的铁聚集中的作用尚不清楚，因此，本实验应用细胞培 养、全细胞膜片钳技术、分子生物学技术、免疫荧光、RT-PCR，免疫印迹等技术方 法，观察7-KArl,通道的激活对多巴胺能细胞由DMTl贪导的摄铁功能的影响，并进 一步探讨其在PD中的作用。结果如下： 响，diazoxide灌流30min内，细胞内荧光强度较HBS缓冲液灌注组明显降低。 后，DA能神经元的细胞膜出现超极化，自发放电频率降低。 响。结果显示给予Fe2+灌注后细胞内荧光较单独FIBS缓冲液灌注组出现明显的衰减， 用100}_tmol／L的Fe2+和100 Fe2+灌注组出现明显减弱。 的影响，结果显示给予Fe2+灌注后干涉组细胞内荧光强度与空载体组细胞相比明显增 强。用100 荧光强度与空载体组相比明显增强。 携带DMTI+IRE的重组腺病毒感染细胞，应用全细胞膜片钳记录K岍通道开放剂 快速诱导出铁电流，并且电流的衰减减缓。 6、应用电感耦合等离子体发射光谱仪检测SK-N．SH细胞铁含量的变化，结果显 示100,mol／L 孵育组相比明显增加。应用流式细胞仪观察细胞内△kUm以及活性氧物质(ROS)的 △kUm与单独100¨mol／L的Fe2+孵育组相比明显降低，而ROS生成明显增高。 达Kir6．2和SURl的细胞和空载体细胞上，分别给予100 100 Fe2一共同孵育，高表达组细胞的摄铁功能以及细胞内的铁含量与空载体组 pmol／L 相比明显升高；细胞△1I，m明显降低，ROS生成的量明显增多。 8、分别用100 I．tmol／L、200I．tmol／L、300