CCCTC-结因子(CTCF)入核运输机制的初步研究.pdfVIP

中文摘要 CCCTC。结合因子(CTCF)入核运输机制的初步研究 中文摘要 CTCF(CCCTC．结合因子)是在真核生物中广泛表达且进化保守的11锌指 蛋白。它的ll锌指结构组成DNA结合结构域，并通过不同的组合方式结合到靶 位点处并行使各种各样的功能，包括基因的抑制与激活、基因印记以及染色质绝 缘等。目前，人们对CTCF的功能进行了广泛的研究，但是没有对CTCF的入核 运输过程进行相关的研究。CTCF作为一个与细胞生长增殖及肿瘤发生等相关的 重要调控因子，它的核运输过程关系着其一系列转录调控作用的发挥。 研究发现CTCF这种大分子核蛋白的入核需要其NLS序列识别相应运输受 体，进而被介导入核运输。入核运输的过程除IIl】[mA被TAP／NXF家族成员介导 外，几乎都是由一个完全保守的转运受体超家族——-Karyophe血s家族所运输。 因此，本课题旨在寻找与CTCF存在相互作用的融ryopher如蛋白家族成员，并 初步研究CTCF入核的具体过程及在此过程中存在的调控方式。由于CTCF在细 胞生长增殖、系统发生以及肿瘤发生等方面都起着重要的作用，而且有研究发现 CTCF的细胞分布与乳腺癌的分级及侵袭性密切相关，故我们还初步研究了 CTCF的入核运输过程与肿瘤侵袭性的相关性。 本研究的主要内容是基于基因芯片的数据结果展开的。之前，利用ChIP-0n 蛋白家族成员In啪rtin13(IP013或m佃13)的基因启动子区结合，且数值非常 (Ⅺ)NA4)。以这些数据作为基础，本课题首先利用免疫荧光染色技术以及相应 文献报道的数据探讨了CTCF的表达水平、细胞分布以及肿瘤细胞侵袭性之间的 关系。我们发现在高侵袭细胞中CTCF多分布于细胞质中，而在低侵袭细胞中 CTCF主要集中分布在细胞核内。 然后，本课题利用染色质免疫共沉淀实验验证启动子芯片的结果，进一步证 明CTCF在勿DJ，启动子区有结合。利用半定量PCR和免疫印迹技术检测实验 Ⅺ)NA4蛋白的表达情况，确定CTCF具体的调控作用。实验发现，CTCF的细 ● !塞塑茎 胞表达水平较低的时候，m013和l@NA4的表达量也有不同程度的下调。说明 CTCF对这两种蛋白起正调控作用。 同时，用GST融合蛋白沉降技术以及Co．m实验检测CTCF与口013和 ⅪPNA4蛋白的相互作用情况。GST融合蛋白沉降技术中构建了表达GSB口013 GEX_4T．1． 及GST-la)NA4这两个融合蛋白的表达载体pGEX_4孓1．口013和p 间都存在相互作用。Co．m实验中首先利用CTCF的抗体免疫沉淀下来的蛋白复 合物进行SDS．P!AGE，Wrestem Blotting时用IP013的抗体进行检测，结果为阳性。 用CTCF抗体检测时结果也呈阳性。 本课题还初步研究了CTcF对其入核运输的自身调控机制，这可以加深我们 对CTCF及其调控网络的了解。 ● ‘ 13；基因表达调控； 关键词：CCCTC．结合因子；karyophe咖alplla4；hnportin 核运输； 5 英文摘要 themechanismnuclearof researchabout Of Preliminary import factor CCCTC-binding Abstract