Sox-HMG子标记方法机制及其应用研究.pdf

摘 要 生物的遗传变异是生物学研究的核心主题，而遗传标记则是揭示 生物遗传变异信息和规律的重要工具之一。遗传标记的发展体现着生 命科学的发展，这种发展不仅是技术水平的进步和理论成果的获取， 更是对生命本质的认识不断深化、系统化的反映。DNA条形码技术 是新一代的DNA遗传标记，它提供了一种快速且廉价的物种鉴定方 法，即使是非物种分类学家也可以使用这个工具获取生物系统学信 息。DNA条形码技术的发展为新分子标记的开发提供了重要的思路： 选择核基因区域，从而避免单性遗传的线粒体基因在系统发生分析时 的偏向性；最好是具有保守结构域的、含有多个成员的基因家族，实 现多基因的交叉验证；所选择的目的基因结构区域应当具有高度保守 性，从处于不同的系统发生谱系的各种不同的动物类群中都能得到扩 +曲 a--f三I-o SOX基因家族成员具有一个编码80个氨基酸残基的高度保守的 分子标记方法通过针对Sox基因HMG域保守序列设计特殊简并引 物，可以从各种不同动物的基因组中扩增获得具有特定数目和长度的 ＼ 岳- DNA片段，这些片段构成物种特异的Sox—HMGDNA条带模式；并 进一步通过克隆测序，获得这些DNA片段特异的DNA序列，从而 获得多水平、交叉验证的物种特异Sox—HMG分子标记。本研究将具 有高度保守结构的基因家族成员作为研究对象，创新性地开展了分子 标记研究，为Sox基因研究和分子标记研究提供了可供借鉴的新的思 路。通过揭示Sox．HMG分子标记方法的基本原理和作用机制，探讨 这一全新分子标记方法的适用性和实用性。拓展Sox．HMG分子标记 方法应用领域。本文的主要研究内容如下： 1．采集属于不同分类类群的动物物种基因组DNA样本；利用针 对Sox基因HMG结构域保守序列设计的特殊简并引物，使用PCR 技术扩增基因组DNA样本；利用琼脂糖凝胶技术，分离PCR产物， DNA条带模式；利用PCR产物纯化和 获得各动物物种的Sox．HMG DNA序列。 克隆技术，获得Sox．HMG DNA序列开展比较分析，结合SSCP技 2．对获得的Sox．HMG DNA 术对Sox．HMGDNA片段进行进一步分离，研究产生Sox．HMG 条带模式多样性的原因，阐述Sox．HMG分子标记方法作用机制；在 揭示Sox．HMG分子标记方法基本原理和作用机制的基础上，与现有 的其他DNA分子标记方法比较分析，主要是与DNA条形码技术比 较，对比讨论Sox．HMG分子标记在生物系统学研究、遗传育种研究 和实际应用中的优势。 码序列构建系统进化树，开展系统发生学研究；利用Sox—HMG分子 标记方法，在多种动物物种中获得Sox9基因HMG域DNA序列，对 扩增获得的Sox9基因HMG域序列开展结构分析；对扩增获得的鲤 科鱼类Sox9基因HMG域内含子开展系统进化讨论。 4．使用Sox．HMG分子标记方法在异源四倍体鲫鲤中获得Sox4 基因5’端调控区序列；利用PCR扩增、限制性酶切等方法，构建Sox4 启动子重组质粒；以绿色荧光蛋白基因为报告基因，通过显微注射方 法，研究Sox4基因在异源四倍体胚胎中的转录情况，探讨Sox4基因 功能。 研究结果证明，Sox．HMG分子标记是一种全新的、基于Sox基 子标记方法的基本原理和作用机制，证明了这一全新的方法在各分类 类群的不同动物物种系统生物学研究中具有广泛适用性。并且这一方 法特别适用于在远缘杂交遗传育种工程研究中，区别和鉴别具有复杂 遗传背景的不同品系。本研究将具有高度保守结构的基因家族成员作 为研究对象，创新性地开展了分子标记研究，为Sox基因研究和分子 标记研究提供了可供借鉴的新的思路。利用所获得的Sox．HMG相关 序列，开展了系统进化分析和内含子进化研究，证明了这一全新的分 子标记方法为系统进化研究提供了丰富的遗传信息。构建了 倍体胚胎中的转录情况，探讨了异源四倍体鲫鲤Sox4基因功能。同 时，进一步证明了Sox．HMG分子标记在基因功能研究领域的潜在价 值。 关键词：Sox基因，HMG结构域，