SsNHXI基在紫花苜蓿中的表达及其耐盐性研究.pdfVIP

摘 要 泡膜型Na+／W逆向转运蛋白全基因序列，构建了该基因的植物表达载体并转化紫 花苜蓿，并对获得大量转基因苜蓿材料进行了耐盐性研究。 猪毛菜液泡膜型Na+／矿逆向转运蛋白全基因(SsNHXl)序列全长为1934bp， 包含一个长度为1680 frame，oe,y)，编码559￡1a个氨 bp的开放阅读框(openreading 基酸残基。液泡膜型Na+／一逆向转运蛋白的高度保守区．抑制剂氨氯吡嗪脒结合 特有的12段跨膜疏水结构域在蛋白序列中被发现。氨基酸序列多重比对分析表 明，该蛋白与来自盐爪爪(Kalidiumfoliatum)、北滨藜(AtriplexgmelinO、紫花苜蓿 thaliana)、水 (Medicagosativa)、棉花(Gossypiumhirsutum)、拟南芥(Arabidopsis mays)的液泡膜型Na+僧+逆向 稻(Oryzasativa)、大麦(Hordeumvulgate)和玉米(Zea 转运蛋白相比，相似性分别达到了90％，87％，77％，76％，75％，74％，73％和 72％。进化树分析表明，该蛋白与其他液泡膜型Na+／矿逆向转运蛋白亲缘关系较 近，而与质膜型Na+／H+逆向转运蛋白亲缘关系较远。在液泡膜型Na+／H+逆向转运 蛋白中，与盐生植物．盐爪爪、北滨藜亲缘关系较近，而与甜土植物亲缘关系较 远。该基因在酵母中表达能够提高酵母的生长速率，在烟草中表达能够有效的提 高T1代转基因种子在含盐培养基中的发芽率，并且生物量和株高都比对照有明显 的提高，充分验证了该基因抗盐功能。总之，SsNHXl基因是液泡膜型N涮逆 向转运蛋白基因家族的一个全新成员，同时，在植物中过表达此基因能够明显的 提高转基因植株的耐盐碱能力。 苜蓿的基因型是影响苜蓿遗传转化的关键因素，只有很少的栽培品种适合建 立高效的再生体系。本研究以14份国内外主栽品种作为供试品种，通过比较品种 间的诱导能力，筛选到公农l号为最佳的基因型。在此基础上，以公农1号的嫩叶 为外植体，建立了一套高效的农杆菌介导苜蓿遗传转化体系，成功将猪毛菜液泡 膜型Na-肘逆向转运蛋白基因导入苜蓿基因组中。Southern杂交证实有6个独立转 化系为转基因阳性株系，最终获得了203株阳性植株。 本研究以来自6个独立转化系的苜蓿植株作为耐盐试验材料，进行盐胁迫试 验。Northern杂交证实外源基因．猪毛菜液泡膜型Na机r逆向转运蛋白基因，在逆 境胁迫启动子调控下，随着盐处理浓度的增高而表达量也逐渐增高。耐盐试验表 明，与对照相比转基因植株具有明显耐盐能力，最高耐盐能力达至U400mM，而 对照在200 mM的条件下逐渐死亡。并且转基因耐盐植株中具有更高Nr，10的含 量。生理分析表明，在盐胁迫条件下，转基因耐盐植株受到的伤害要比对照植株 轻的多。转基因植株的超氧化物歧化酶(SOD)活性变化趋势小和脯氨酸含量增长 幅度小，另外，转基因植株的相对电导率(REL)变化也较小，这些生理数据表明， 猪毛菜液泡膜型N棚逆向转运蛋白基因的表达能帮助转基因植物抵抗盐胁迫， 有效的提高了转基因植株的耐盐能力。 关键词：基因克隆；耐盐能力；RACE；农杆菌介导遗传转化；紫花苜蓿(Medicago sativa L．)；液泡模型N珊逆向转运蛋白基因 II Abstract Inthis study,a completevacuolar-typeN客晴antiportergene(SsNHXl) putative wasisolatedfromthe Salsolasoda the of gene halophyte byusingrapidamplification eDNAends SsNHXlwasconstructedintoa