SARS冠状病Plpro蛋白酶的生物学功能研究.pdfVIP

SARS冠状病毒PLpro蛋白酶的生物学功能研究 中文摘要 SARS冠状病毒基因组由29．7I(b的正义、单链RNA组成，基因组的前2／3 protea∞，PLpr0)和3C样蛋白酶(Chymo仃ypsin-likcpnotea∞，3CLpr0)的作用下， 将其切割成16个非结构蛋白(nspl．16)，16个非结构蛋白在内质网膜上组装成一 个多功能的复制酶复合体。此复合体介导完成病毒基因组的复制和结构基因的转 录翻译。不同于其他已知冠状病毒编码两个木瓜样蛋白mPl和PLP2)，SN玛 冠状病毒只编码一个木瓜样结构域PLpr0。S舢塔PLpr0特异性识别多聚蛋白ppla (1)pl 蛋白酶结构与功能研究是近几年冠状病毒分子生物学研究的热点之一。 SARS 小的结构域NAB．G2M。PLpr0由四个不同结构域组成，最开始的62个氨基酸形 成一个独立的泛素样N末端结构域(．Ubl)。其余三个组成一个伸展的右手结构包 括掌心、拇指和指形结构域。本研究利用基因重组技术首先构建了带有1M跨膜 域的PLp∞．1M重组质粒，并构建了缺失泛素样结构域Ⅳb1)和NAB．G2M结构 域的重组质粒。其次，利用PCR定点突变技术将PLpr0中与蛋白酶催化活性 相关的三个关键氨基酸残基Cys．His-Asp突变为Ala，构建出三种酶活性缺失突 变体。 经生物信息学预测发现，SARS PLpr0蛋白酶的高级结构与细胞内去泛素化 酶HAUSP高度相似，因此，推测PLpr0同样具有去泛素活性。为了验证此推测， 本研究以SARS冠状病毒PLp∞蛋白酶为研究对象，将HA．Ub与PLp∞基因共 转染HEK293T细胞，发现PLpr0能显著减少细胞内蛋白的泛素化修饰(包括 K63、K48修饰泛素形式)作用，此实验证实了PLp∞具有体内DuB活性，利 用同样方法，检测到带有跨膜域1M的PLpr0同样具有DUB活性。并且缺失泛 点突变后对其DUB活性有一定影响，提示PLp∞的蛋白酶活性位点同样为去泛 素活性的重要位点。 病毒感染宿主细胞后，病毒核酸可被细胞膜上受体(TLR3)及胞内受体 (对G．D所识别，募集下游衔接蛋白(IPS．1、EⅪS、Ⅱ认F3等)，活化的衔接蛋白 SARS冠状病毒PLpr0蛋白酶的生物学功能研究 IRF3、IRF7等核转录因子，核转录因子入核启动干扰素基因的转录、翻译，从 而上调细胞中的IFNp表达。表达的干扰素与其受体结合，激活下游干扰素信号 通路，最后翻译出上百种抗病毒蛋白来抑制病毒复制。以SARS冠状病毒为研究 等)激活IFND通路，裂解细胞检测荧光素酶报告基因活性，发现Sendai病毒或 通路中调节蛋白都可明显激活IFND通路，而共转PLp∞以后，荧光素酶活性明 显降低，证明PLp∞对IFNB通路具有明显的负调节作用，是一种IFN拮抗分子。 利用同样方法，检测到缺失泛素样结构域Ubl或NAB．G2M结构域的PLpr0对干 D1826A抑制干扰素通路也很明显并具有剂量依赖性。 我们前期研究发现，SARS PLpr0可通过与转录因子IRF3相互作用并抑制其 磷酸化和阻断其向胞核转运，从而抑制宿主干扰素表达。但最新研究证实，PLpr0 并不与IRF3直接相互作用，因此，SARS PLpr0抑制宿主干扰素通路分子机制还 不清楚。针对这一问题，本研究进一步对PLpr0抑制干扰素通路的抑制机理方面 进行探索。首先，利用C0-IP技术检测PLpr0．1M与通路中蛋白的相互作用情况， 与不存在的情况下，检测两蛋白的相互作用情况，以此方法检测到，PLp∞．删 结果提示，PLpr0可通过阻断1RAF3复合体的形成而抑制Il江3的活化，从而抑 制其二聚化入核上调干扰素的表达。除此之外，蛋白泛素化修饰是调节天然免疫 应答的关键机制。泛素化修饰同磷酸化一样，是一种可逆的共价修饰，通过泛素 化修饰可调节靶蛋白的稳定性、活性及细胞内定位等。泛素化修饰存在于天然免 疫应答的各个时期。通路中许多分子如鼬G．I、TRAF3、EⅪS、Il心3等都可进 行泛素化修饰，IuG．I的K63多聚泛素化修饰是活化下游IPS．1衔接蛋白的基础： 上调干扰素的表达。那么，PLpr0作为病毒编码的新型DUB对这些泛素化分子 是否具有作用活性?本研究将通路中泛素化修饰分子ⅪG．I、TRAF3、EⅪS、IlU3 与泛素共转脏K2