人TIM-3基的克隆及其真核表达.pdfVIP

111[11 1 11 11IIIIII I I IIl Y1747062 摘要 摘要 研究背景与目的： 和Th2细胞在机体免疫中起不同的作用。Thl型细胞主要介导针对细胞内病原体 如细菌、病毒感染引起的细胞免疫，Th2型细胞主要介导体液免疫和过敏反应等。 T细胞免疫球蛋白黏蛋白结构域相关分子(T-cell and immunoglobulin mucin．domain．containing Tim家族中的一个重要的成员，它是终末分化的Thl细胞表面标志，不表达于初 进而推测Tim．3可以通过调节Thl细胞反应，从而调节机体的免疫功能。但近年 NK细胞、树突状细胞、肥大细胞和某些肿瘤细胞上表达。Tim．3在这些细胞中表 达的作用各有差异，提示Tim．3除了调节Th免疫反应外可能还具有多种生物学作 用，但是其确切作用尚不清楚。为此，本文从人外周血单个核细胞(PBMC)@用 RT-PCR的方法扩增出人Tim．3eDNA，构建出人Tim．3的真核表达载体。并观察 了其在肝癌细胞和巨噬细胞中的表达，为后续研究进一步研究其生物学功能并 最终应用于临床基因治疗奠定基础。 方法： ①获得健康人外周血的单个核细胞并克隆人Tim．3基因：取健康人外周血 RNA，再逆转成cDNA，PCR法获取带酶切位点的人Tim．3基因。 ②人Tim．3基因的亚克隆：带有A尾的PCR产物连接到pGEM．T载体上， LB固体培养基上，37℃培养16-24h出现蓝白斑菌落，挑取白斑单克隆菌落放 入含Amp的LB液体培养基中摇菌，提取质粒，PCR、酶切和测序鉴定是否为 人Tim．3基因。 ③构建人Tim．3基因真核表达质粒：双酶切后的pEGFP-N1真核表达载体和 II 摘要 单克隆菌，挑取单克隆菌，在含卡那霉素的LB液体培养基中扩增大肠杆菌，提 取质粒，最后PCR、酶切和测序鉴定是否为人Tim．3基因。 培养细胞，隔天换液，细胞长满培养瓶90％时传代培养。 脂质体溶液孵育后转染至肝癌细胞SMMC7721和巨噬细胞U937中。荧光显微 镜观察质粒转染细胞48h后绿色荧光表达情况，初步判断转染效率。 结果： ①利用RT-PCR技术从正常健康成年人外周血单个核细胞中扩增出了Tim．3 基因，琼脂糖凝胶电泳证实核酸大小与预计一致，并成功构建了Tim．3基因的重 组质粒pGEM．T-Tim．3。测序结果证实Tim．3基因完整无误的正向单倍插入到 pGEM．T载体中。 access 无误正向、单倍的插入，插入片段与PubMed基因文库(GenBank NM032782．3)中的Tim．3基因序列的相似性为100％。 U937中，RT-PCR结果显示融合基因能有效转录，荧光显微镜下成功观察到绿 色荧光蛋白的表达，且绿色荧光蛋白定位于肝癌细胞SMMC7721和巨噬细胞 U937的细胞膜上，进一步证实了Tim．3蛋白为细胞膜蛋白。 结论： ①本研究用RT-PCR方法，以健康人外周血单个核细胞为模板，扩增出Tim．3 基因，亚克隆至pGEM．T载体，成功构建pGEM．T-Tim一3重组质粒。 ②将pGEM．T-Tim．3重组质粒酶切下带有限制性酶切位点的Tim．3基因和双 @RT-PCR结果显示融合基因能有效转录，荧光显微镜下清晰显示出目的蛋 是细胞膜跨膜蛋白的特点，表明真核表达质粒能够在肝癌细胞SMMC7721和巨 噬细胞U937中表达，且定位准确。 ④成功地构建了pEGFP．N1．Tim．3真核表达质粒，并且在多种真核细胞中表 达，说明其可用性。这为后续研究Tim．3在不同细胞中的作用，及以Tim．3为靶