利用慢病毒介导RNAi技术沉默细胞中MKK6的研究.pdfVIP

摘耍 摘要 丝裂原活化蛋白激酶(mitogen．activatedprotein 内一个重要的信号转导通路，可以将多种细胞外刺激信号传递到细胞核内，在调节细胞 生长、发育、分裂及凋亡中发挥了重要的作用。在哺乳动物细胞中，主要存在四个 ERK5。p38信号通路主要介导了细胞生长、分化和凋亡，在炎症及癌症的发生和发展过 程中起了重要的作用。MKK6是p38的上游激酶，在受到致炎症细胞因子、生长因子和 应急刺激的作用时会通过磷酸化p38而调控细胞发生反应。 RNA干扰(RNAi)是近些年来发现的一种重要的基因沉默技术，通过转录后的基 因的功能及信号转导通路具有重要的作用。目前，用于沉默基因表达的RNA干扰技术 病毒载体。质粒载体和病毒载体可以在宿主细胞内持续稳定的转录出shRNA，而 相比，质粒载体和病毒载体可以长时间、稳定的诱导基因沉默，在研究基因功能等方面 具有更大的优势。 毒载体，对分裂细胞和非分裂的细胞(例如成熟的神经元)都具有很强的感染能力。由 于慢病毒感染宿主细胞后，其基因可以高效的整合到宿主染色体中，因此可以在宿主细 优点，因此广泛用于作为RNAi和基因表达的载体，可以在宿主细胞内稳定的表达 删A或目的基因。 为了进一步研究MKK6基因的功能并明确人宫颈癌细胞中MKK6调控的信号通 对MKK6 粘性末端互补结合而将shRNA片段插入入门载体中。利用LR重组反应，将入门载体 中的RNAi效应结构转移到表达载体中，然后利用阳离子脂质体转染的方法将表达载体 及病毒包装复合体共转染到293FT生产者细胞中进行慢病毒的包装。同时，利用相同的 方法包装出表达LacZshRNA的慢病毒用于作为后续实验的阴性对照。在转染后48和 72小时分别进行慢病毒的收集，然后对慢病毒进行滴度测定和浓缩。 摘要 选出稳定整合慢病毒基因组的Hela细胞系。通过WesternBlot测定各细胞系中的MKK6 表达水平，最终鉴定出MKK6基因沉默的细胞系。 通过本研究，我们得出以下几点结论： 1．成功改良了退火方法，发现梯度降温法可以有效的对合成的慢病毒RNAi双链进 行退火。 2．成功构建出慢病毒入门载体和表达载体，包装出高滴度的慢病毒并对慢病毒进行 浓缩。 3．改良慢病毒收集方法，采用两阶段收集，提高了慢病毒的产量，并发现第二次收 集的慢病毒滴度大概可以达到第一次的1／10。 4．利用Western MKK6表达水平没有发生明显变化。 的Hela细胞系，为进一步研究MKK6调控的信号通路奠定了基础。 关键词MKK6MAPK慢病毒RNAi p38 Abstract Abstract in cells，could Mitogen-activatedproteinkinase(MAPK)，ailimportantsignalingpathway transduce thenuclei．Itan roleincell extracellularinto playsimportant growth， multiple signals and mammalian arefour MAPK apoptosis．In cells，theremajor development，differentiation N—terminal subfamilies，i．e．，extracellular kinase(JNK)，