利用cDNA-FLP技术分析棉花耐旱相关基因的表达.pdfVIP

摘要 干旱是全世界面临的严重问题之一，同时也是制约我国农业生产的主要因 素，因此，提高作物的抗旱能力是现代农业研究工作中的重点和热点问题之一。 棉花是我国乃至全球重要的经济作物，新疆隶属于干旱荒漠地带，气候比较干燥， 同时也是我国最大的棉花生产基地之一，棉花属耗水作物，农业方面用水危机越 来越突出，干旱严重制约着新疆棉花的进一步发展。由于缺乏有效的选择手段及 棉花本身耐旱性状的复杂性，一直以来，人们采用传统的常规选育等方法解决棉 花品种的干旱问题往往工作量大、耗资大而且选择效率不高。随着分子生物学术 的不断发展，运用分子遗传学、分子生物学等方法通过基因工程的手段培育抗逆 品种已经成为现代农业研究的重要内容。本研究以棉花耐旱品种晋棉13 号为研 究材料，利用cDNA-AFLP 技术筛选并克隆与干旱胁迫相关的基因，通过对目的 基因片段在植物不同胁迫时间点及不同组织中的表达量进行分析，进一步解析植 物的耐旱机制，为棉花抗逆育种提供候选基因及理论依据。主要研究结果如下： 1、采用水培法培养了晋棉13 号正常生长和PEG6000(20%和30%)处理1h、2 h 、4h 、6 h、8 h、10 h、12 h 和24 h 的幼苗，提取了高质量的叶片总RNA 。 2 、选用64 对引物组合，对正常生长和干旱处理不同时间点叶片转录产物进 行cDNA-AFLP 分析。共分离得到232 个差异表达的转录衍生片段(TDFs)，对其 中102 个TDFs 进行了克隆、测序和序列分析。结果表明：57 个TDFs 与NCBI 中已有序列同源，8 条为重复序列，比对出同源序列但缺少生物学功能的TDFs19 个，已知可能生物学功能的TDFs30 个。另有45 个TDFs 无同源序列或同源性低， 预测是一些未知功能基因。 3、比对结果显示，已知可能生物学功能的30 个TDFs 分别归属于信号转导、 代谢、光合作用调节、逆境响应等。光合作用调节蛋白基因包括光调节蛋白基因 (TDF89) ；信号转导相关基因包括ATP 结合蛋白基因(TDF3)、磷脂酰甘油磷脂酶 C 基因(TDF45 和TDF62)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(TDF64)、F-box 结构域蛋白 (TDF75)、受体蛋白激酶(TDF93) ；核酸代谢相关基因为推测的反转录酶(TDF34) 和反转录转座子蛋白(TDF7) ；生物合成关键酶基因为淀粉分支酶基因(TDF1 和 TDF2) ；蛋白质合成与修饰相关基因包括RNA 解螺旋酶蛋白(TDF80)、真核翻译 起始因子EIF4A(TDF87) ；逆境响应相关基因包括水稻渗透响应蛋白(TDF12)、抗 锈病蛋白(TDF29) 、冷胁迫相关蛋白(TDF31) 、干旱诱导相关蛋白(TDF42 和 TDF81)、拟响应调控基因(PRR)( TDF52)、耐药分泌蛋白(TDF101) ；代谢途径相 关酶类基因包括乙酰辅酶A 羧化酶(TDF43)、细胞色素P450 基因(TDF5 和TDF 44) 、氨基甲酰磷酸合成酶(TDF60)、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(TDF61)、磷酸转移 酶(TDF70)、NADH 脱氢酶(TDF78)、乙醇脱氢酶基因(TDF97) ；离子转运相关蛋 白为液泡膜H+-ATPase(TDF33) ；转录因子为EREBP 转录因子(TDF76) 。 I 4 、选取三个与棉花耐旱密切相关的cDNA 片段(TDF42、TDF61 、TDF62) ， 利用半定量RT-PCR 法分析其在棉花叶片不同胁迫时间点以及在不同组织中的表 达量，结果表明磷酸烯醇丙酮酸激酶(TDF61)在正常水分供应下表达水平很低， 在干旱胁迫条件下先增强后减弱，在8 小时达到最高值。8 小时根、茎、叶中的 表达量为叶中最高，茎中次之，根中最低；水分胁迫条件下得到的 cDNA 片段 (TDF42)的表达情况为在正常水分供应下基本上无表达，随着时间的延长逐渐增 强，在10 小时达到最高值，后逐渐减弱。10 小时时根的表达量最高，茎中次之， 叶中最低；磷脂酶C(TDF62)在正常供水情况下表达量也低，随着胁迫时间的延 长表达量逐渐增强，在12 小时达到最高，此后表达量基本处于稳定，12 小时时 根茎叶中该基因的表达量差别不大。因此，初步推测这三个TDFs 与棉花耐旱相 关