分子伴侣表达载构建及TEV蛋白酶突变体的功能分析.pdfVIP

mllllllll…mlllll洲洲11lll㈣11IlI 05 Y17351 摘要 外源蛋白在大肠杆菌中重组表达时，常常会错误折叠或形成无功能的包涵 体。有多种方法能用于改善外源蛋白的重组表达，最常用方法是与分子伴侣共表 达或融合表达，但是后者需要高效的蛋白水解酶切除融合表达的分子伴侣。本研 究，构建了含有多个大肠杆菌分子伴侣的辅助表达载体，分析了它们的功能；利 etchvirus 用定点突变技术获得TEV蛋白酶(tobacco protease)突变体，并分析了体 内和体外的活性，获得以下结果： 1．克隆分子伴侣编码基因。克隆大肠杆菌分子伴侣基因dnaK、dnaJ,grpE、 致。 2．构建分子伴侣表达载体。分别将分子伴侣基因插入pRSFDuet．1和 pC．DJCL(含dnaK、dn甜和c伽)。 groES，grpE，dn水andclpB诱导表达的条带明显，但是未检测到dnaJ的表达条 带。 4．分析分子伴侣表达载体的效应。共表达结果显示，分子伴侣促进玉米西罗 叶绿三酸：铁螯合酶和谷氨酸．1．半醛氨基转移酶的可溶性表达，但是对玉米尿卟 啉原III脱羧酶的可溶性表达没有明显促进作用。 5．改造TEV蛋白酶。以TEV蛋白酶$219V为原始体，定点突变疏水性氨基酸 残基，获得两种TEV蛋白酶突变体(TEVQprotease，TEVr 示TEV蛋白酶突变体的可溶性表达水平在重组大肠杆菌中有明显提高，每升菌液 纯化获得约165 mg的重组TEVQ蛋白酶，108mg的TEVF蛋白酶，明显高于报道的 野生型TEV蛋白酶。 6．分析了TEV蛋白酶的活体和离体活性。TEV蛋白酶与含有TEV酶切位点的 融合蛋白共表达，电泳显示能有效切割融合蛋白，利用纯化的TEV酶，消化纯化 的含有TEV蛋白酶酶切位点的融合蛋白，电泳显示它能有效切割靶蛋白，TEVQ 蛋白酶的活性明显高于TEVF蛋白酶。 综上所述，本文构建了两个分子伴侣辅助表达载体并分析了它们的表达水 平。研究结果显示分子伴侣对改善不同外源蛋白可溶性表达的效率不同，与靶蛋 白的内在性质有关；获得的TEv蛋白酶突变体，与报道的野生型相比，表达量得 到很大提升，在体内和体外都具有较高的活性，为TEV蛋白酶在蛋白的可溶性表 达及蛋白标签的应用奠定基础。 关键词：分子伴侣，TEv蛋白酶，定点突变，大肠杆菌 Abstract is most usedhostfor Escherichiacolithe of extensively productionhomologous inEcoli recombinant oftenfailto foldand proteins．However，the proteins properly asinclusionbodies．Theseveral determinedto were overexpressed chaperones help the recombinant orasthefu