家蚕四氢生物蝶合成相关酶基因的克隆表达与酶活性分析.pdfVIP

摘 要 芳香族氨基酸羟化酶及一氧化氮合酶在神经系统和内皮功能中有着重要的作用。 四氢生物蝶呤(BH4)作为这些酶的重要辅助因子，其合成或再生障碍会导致神经递 质的缺乏以及细胞内皮功能障碍。临床医学上把口服BH4作为治疗某些疾病的有效 方法。然而通过化学方法合成BH4比较困难，以致经化工合成的BH4价格非常昂贵。 墨蝶呤(SP)是一种昆虫内源性色素，大量沉积于黄体色家蚕突变体(把聊)的幼虫体 表。SP是经补救途径合成BH4的前体。为了开发高效低耗、程序简单、产量可观的 BH4体外合成工艺，本研究开展了家蚕BH4补救合成途径相关酶，墨蝶呤还原酶 学特征。 cDZfRosetta 本实验首先将前期研究得到的重组质粒pET-24b／BmSPR转化至E (DE3)，用IPTG进行了不同浓度和不同时间的诱导表达，优化了蛋白的表达条件。 SDS电泳和WeStem B10t的检测结果表明家蚕SPR融合蛋白能够在原核表 达系统中稳定表达。根据己公布的家蚕基因组精细图谱和EST等公共数据库的序列 信息，我们设计特异性引物克隆出家蚕B蒯弛厅基因的cDNA序列，获得其OI心。 EcDZf BL21(DE3)菌株中也得到了正确表达。 测定浓度后，对其酶活性进行分析。为进一步研究重组蛋白的最适反应条件，本研究 通过改变底物浓度、反应时间、反应温度、反应液pH等因素，以观察酶活性的变 好的催化活性。 家蚕是重要的经济昆虫之一，并且日益成为基因工程的重要研究对象。本实验利 用具有培养操作简单、成本低廉、可以快速大规模地生产目的蛋白等优点的大肠杆菌 究成果对于今后利用从家蚕彪朋突变体中大量提取的SP为底物，体外合成BH4的 生物制药方面的应用基础研究具有重要意义。 关键词：四氢生物蝶呤，墨蝶呤还原酶，二氢叶酸还原酶，原核表达，酶活性 Abstract t11e cofactor for Itis、venestablishedt11at na_mraJ te眦lydrobiopterin(BH4)isrequired amin0acidsandIli仃icoxide an tlle of也earomatic s弘1mesis，w11ichplays hydroxylation in andendo也eli2Llfunctions．BH4haSbeen import龇roleneuropsychj撕c deficiency aSsociatedwitll animal andcl洫cal maIlynellropsych0109icaldisorderS．Mallyexp砸ments rese眦hes t11atBH4 diseaSescouldbe oral suggested deficiency-depen(1entimproVedby ofBH4．Becauseofme ofBH4is of addminis似ion chemic酊s)，11tllesis di面cult，me研ce BH4is oneof tofonllinSect Very