棉铃虫核型多角病毒(HaSNPV)G4株Ha99蛋白的原核表达和orf99敲除回复子的构建.pdfVIP

摘要 ＼1726641 摘要 棉铃虫单核衣壳核型多角体病毒(Helicoverpaarmigerasinglenucleocapsid DNA病毒，其G4株全基因组的测序工作已经完成。该基因组共有135个开放阅读框 (openreading 是其中一个功能未知的基因。 一级结构分析发现该蛋白等电点为8．80，为一碱性蛋白。 合在大肠杆菌彪刀中进行原核表达，预期蛋白分子量大小为39．5kDa。经过多种条 件的摸索，包括改变诱导剂IPTG的浓度，诱导时间，诱导温度，表达载体，表达 宿主细胞等，我们最终得到融合蛋白GST-Ha99包涵体形式的大量表达，大小与预 期分子量相符，表达结果还通过Westernblot分析得到验证。该蛋白的成功表达 为进一步研究其功能奠定了基础。 为了进一步研究ORF99的功能，我们在其上下游设计了一对同源臂，在棉铃虫 Rep99。因 为杆粒HaBacHz8与野生型棉铃虫核型多角体病毒相比不含有多角体基因，所以我 转移到HaBac△99中得到aaBac-dualRep99。由于杆状病毒有两种不同的病毒粒子： dual Rep99就能在包涵体型病毒粒子中进行ORF99功能的研究，而不带有多角体基 Rep99就能在芽生型病毒粒子中进行ORF99功能的 因的HaBac△99和HaBac-single 研究。因为HaBac△99中含有绿色荧光蛋白基因，这就为在细胞水平上研究ORF99 的缺失对病毒复制的影响提供了方便。 关键词：棉铃虫单核衣壳核型多角体病毒，ORF99，原核表达，缺失，回复 Abstract Abstract tothe Helicoverpaarmigerasinglenucleoeapsidnucleopolyhedrovimsbelongs isakindofviruswith Baculovirus circo·double—stranded Nucleopolyhedrovims．It the workofitsG4strainhasbeen are135 DNA，and completed．There sequencing the 115ORFsare ORFs genome，and conservative，20 ORFs(openreadingframe)in are isanunkownwithitsfunctioninthem． special．ORF99 gene Thereare357nucleotidesin 118aminoacidswillbe in ORF99，and coded and inthe are signal CAGTTATA anticipate．Thereearlypromotersequence ofstart