登革2型病毒包E蛋白中和表位的确定及其功能分析.pdfVIP

中文摘要 中文摘要 在登革病毒编码的三种结构蛋白中，包膜E蛋白是病毒的主要结构蛋白，位于成 熟病毒颗粒表面，构成病毒颗粒的突起。E蛋白在空间上形成3个不同的结构域(I， II和III区)，在病毒吸附、与宿主细胞膜融合以及病毒组装过程中具有重要的作用。 而且，E蛋白也是病毒的主要抗原，含有多种抗原表位，可通过诱发中和抗体产生保、 护性免疫应答，在机体抵御登革病毒感染的过程中发挥重要作用。然而，登革病毒E 蛋白，特别是III区外的构象型中和表位的精细结构尚未完全阐明。其次，不同型和 同一型毒株之间在抗体结合位点上的差异及其对病毒组织嗜性、复制效率及致病性等 的影响也还有待于进一步分析。此外，E蛋白上与登革病毒免疫病理密切相关的ADE 表位也知之甚少。这些问题阻碍了对登革病毒致病和免疫分子机理的阐明。因此，确 定登革病毒E蛋白中和表位和ADE表位，阐明抗体中和作用的分子机制，以及进一 步探讨与E蛋白重要生物学功能相关的一些关键氨基酸残基，不仅是了解其分子机制 的第一步，也为登革特异性防治提供重要信息。 本项研究利用登革2型病毒E蛋白特异单抗，分析了病毒E蛋白的中和表位，明 确了抗体结合的关键位点及其中和作用的机制，并初步探讨了重要氨基酸位点突变对 病毒生物学特性的影响。研究主要包括四个部分： 一、 登革2型病毒包膜E蛋白特异单克隆抗体的制备 为了制备登革2型病毒E蛋白特异单抗，我们分别以灭活的登革2型病毒和构建 的病毒全长prM．E基因的真核重组质粒DNA作为免疫原，采用常规方法建立分泌登 革2型病毒E蛋白单抗的杂交瘤细胞系。最终获得了10株登革2型病毒特异单抗 (288、2Hl 为了对这10株单抗所针对的病毒蛋白进行鉴定，我们以稳定表达登革2型病毒 prⅧ蛋白的细胞制备的抗原片对其进行IFA检测。结果证实，这10株杂交瘤细胞所 分泌的单抗均是针对prM．E抗原的。然后，以大肠杆菌表达的E蛋白I．II区或III区 为抗原，采用免疫印迹和ELISA法鉴定单抗所针对的抗原表位。结果发现，除2AlOG6 和2FlO结合E蛋白I．II区外，其余单抗均针对E蛋白III区。此外，对这些单抗的交 6株均具有黄病毒交叉反应活性。上述结果表明，我们获得了针对登革2型病毒E蛋 白不同的结构域、对黄病毒属成员具有不同反应性的单抗，为E蛋白抗原表位分析、 登革新的诊断试剂以及新型疫苗和抗病毒药物研究提供重要工具。 二、 登革2型病毒E蛋白特异单克隆抗体的中和作用机制 我们采用蚀斑中和减少试验和乳鼠保护试验观察这10株登革2型病毒E蛋白特 中文摘要 革2型病毒具有较强的中和活性和免疫保护作用。其中E蛋白I．II区特异单抗2A10G6 的小鼠存活。此外，单抗2A10G6还有效中和登革l、3和4型、黄热和西尼罗病毒， 与目前已知的黄病毒交叉中和抗体比较，具有更加广谱的黄病毒交叉中和活性。 为了确定登革病毒E蛋白特异抗体中和作用的机制，我们采用定量RT_PCR法和 蚀斑法测定单抗(288和2A10G6)是在病毒增殖周期中的哪一个阶段抑制病毒的感 染。结果显示，288主要抑制登革病毒增殖周期中的吸附阶段，抑制倍数达3．1；而 2A10G6可在病毒吸附后的病毒E蛋白与宿主细胞膜融合阶段发挥其中和作用。上述 结果说明，这2株中和抗体可通过结合其不同的中和表位在病毒增殖周期的初期阶段 抑制登革病毒的感染。另一方面，我们在人单核细胞K562上观察了亚中和浓度的单 抗2A10G6是否可增强登革1-4型病毒对表达FcY受体的单核细胞的感染。结果发现， 亚中和浓度的单抗2A10G6可增强4个型登革病毒对单核细胞的感染，增加倍数达 5．10倍，表明该中和抗体具有感染增强活性。 三、 登革2型病毒E蛋白中和表位的筛选与鉴定 为了分析登革病毒E蛋白中和表位，我们首先采用噬菌体随机肽库对单抗 2A10G6结合的多肽进行筛选。结果显示，该单抗所对应的多肽序列位于登革2型病 毒E蛋白融合多肽的％D删101区域。采用ELISA法进一步证实了相应的合成多肽 可与单抗2A10G6特异结合。序列比对发现，该多肽序列在所有黄病毒的E蛋白氨基 酸序列中是高度保守的。根据E蛋白晶体结构，我们发现由D98、R99和W101位氨 基酸残基可构成一个2AlOG6结合的构象型表位，该表位暴露在登革2型病毒E蛋白 Ⅱ区顶端融合多肽的表面，且其空间构象在不同黄病毒E蛋白结构中是较为