《实验三　 血清蛋白聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳》.doc

课程名称： 生物制药技术实验 第 3 单元（节）， 4 学时，授课时间2010 年11月9日，地点 202 项目/主题： 实验　 血清蛋白聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳血清蛋白聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳 1.凝胶柱的制备：每人制支凝胶柱。①取10×0.6cm的玻管，从一端量取7cm及7.5cm两处，分别用玻璃铅笔划线。另一端管口则垂直插入橡皮垫中。②按表配制分离胶溶液。用滴管将其沿管壁注入玻璃管至7cm划线处，如有气泡，必须设法排除。凝　胶　溶　液　的　配　制试　剂 分离胶（ml） 浓缩胶（ml） 　　分离胶缓冲液 2.5 － 　　 2.5 0.5 　　浓缩胶缓冲液 － 1.25 　　蒸馏水 4.7 2.9 　　TEMED 1滴 1滴 　　10％过硫酸铵 0.1 0.05 　　总体积（ml） 10 5.0 　　丙烯酰胺浓度（g） 7.5 3.0 ③随即用5ml注射器经针头沿凝胶管壁缓慢加入蒸馏水约0.5cm高度。注意防止胶液表面的震动与混合。④静置约20~30分钟，在凝胶表面与水之间出现清晰的界面，表示聚合已完成，用滤纸条轻轻吸去凝胶表面水份，注意不能损坏己聚合的凝胶表面。⑤按表配制浓缩胶，立即用滴管将其加至玻管中分离胶上至7.5cm划线平面，再沿管壁缓慢加入蒸馏水约0.5cm高度，放置30分钟左右，凝胶与水之间出现界面，说明聚合完毕，用滤纸轻轻吸除水份待用。样品配制：取血清30ul，加0.025％溴酚蓝5ul，20％蔗糖65ul。电泳：①将上述制备好的凝胶管分别插入上电泳槽槽底下的橡胶塞孔中，按管做好标记。②加入2倍稀释的电极缓冲液于下电泳槽中，随后放入凝胶管，用弯头滴管排除凝胶底的气泡。③用微量注射器吸取样品液10ul，沿管壁加在浓缩胶面上，再用2倍稀释的电极缓冲液轻加在样品液上，一定不能冲散样品液。④将上电泳槽的电极接至电泳仪的负极，下电泳槽的电极接至电泳仪的正极。接通电源，调节电流为1mA/管，10分种后再调节电流为4~5mA/管。待示踪染料迁移到管下口约0.5cm处时，切断电源。（电泳时间约2.5小时）。⑤取下凝胶管，用带有10cm长针头的注射器，内盛蒸馏水（作为润滑剂），沿管壁插入管内，边插入边注水，直至胶柱与管壁分开，然后用橡皮球轻轻在胶管的一端加压，使凝胶柱从管中慢慢滑出，防止滑出过快而冲断凝胶柱。4.固定、染色与脱色：①将胶柱置于固定胶中固定30分钟。②再将凝胶柱放入小试管或培养皿中，加入考马斯亮兰染色液，60℃中染色30分钟，或室温下染色40~50分钟。③然后将胶柱移至脱色液中，脱色10分钟，换脱色液1次放置过夜，脱色完成后，在7％醋酸中保存，仔细观察血清蛋白的色带条数。烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺是神经性毒剂，对皮肤有刺激作用，应避免直接接触。泳完毕后，上下槽电泳缓冲液不能搞混，因离子强度和pH都已发生改变。硫酸胺溶液最好新鲜配制，最长不得超过一周。聚合的时间与温度有关，如室温＜10℃，聚合时间将延长。烯酰胺的重结晶；将丙烯酰胺溶于50℃氯仿中（70g/L），热过滤。将滤液冷至室温，置－20℃冰箱中过夜重结晶，用冷的布氏漏斗过滤回收结晶，用冷氯仿淋洗，真空干燥（纯化的丙烯酰胺水溶液的pH值是4.9~5.2，只要pH值变化小于±0.4pH单位，就可使用）。叉双丙烯酰胺重结晶，12g甲叉双丙烯酰胺溶于40~50℃的1升丙酮中，热过滤，将滤液慢慢冷却到室温，置一20℃冰箱中过夜，过滤收集结晶。用冷丙酮洗涤后，真空干燥。烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺贮液宜贮于棕色瓶中，保持干燥与较低温度（4℃）以减少水解，但只能贮存1~2月。可测pH值（4.9~5.2）来检查是否失效。失效液不能聚合。甲基乙二胺要密封贮存。10％过硫酸铵 课程单元设计 1 第页（共4页）