《实验三、琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA》.ppt

分子生物学实验 课件作者：蒋华云 琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA 实验目的 学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术 检测上次实验课提取的质粒DNA 实验原理 电泳 带电物质在电场中的趋向运动称为电泳。凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵敏等优点，已成为蛋白质、核酸研究的首选标准方法。 泳动率 泳动率是带电颗粒在一定的电场强度下，单位时间内在介质中的迁移距离。 影响泳动率的因素 样品的物理性状（分子大小、电荷多少、颗粒形状和空间构型） 支持物介质（琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶） 电场强度 缓冲液离子强度（最适离子强度一般在0.02～0.2之间） DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动的电荷效应和分子筛效应 DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动 在一定的电场强度下， DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型 质粒DNA分子的3种构型 超螺旋的共价闭合环状质粒DNA（covalently closed circular DNA，简称CCCDNA） 开环质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA一条链断裂（open circular DNA，简称OCDNA） 线状质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA二条链断裂（linear DNA，简称L DNA） 实验仪器 分析天平 微波炉 移液器（10uL） 琼脂糖凝胶电泳系统（水平槽） 紫外线透射仪（或凝胶成像系统） 琼脂糖凝胶电泳系统（水平槽） 水平槽电泳系统的使用 制备1%琼脂糖凝胶 （1）按水平槽制胶板操作说明，将制胶板安装好，调节水平。 （2）称取0.25g琼脂糖，加25mL1×TAE电泳缓冲液，微波炉加热至完全透明，凉却至60度时，加入1μL1%EB，摇匀倒板。 记录加样的顺序和加样量 （3）待琼脂糖凝胶完全凝固，将胶板放入电泳槽，加入1×TAE电泳缓冲液，通常加至没过胶面2mm，拔去梳子。 （4） 选择一个加样孔加入5μLDNA marker 2000或15000 （5）吸取5 μL样品DNA和1 μL 6×凝胶加样缓冲液混匀，加入加样孔。（注意：此混匀操作可在一次性手套上完成。） 电泳 （6）接通电泳槽和电泳仪电源，调节电压为100V，稳压电泳25分钟。（注意：DNA片段从负极向正极移动，即加样端靠近电泳槽负极。） * * 缓冲液 染料指示剂 琼脂糖凝胶 电泳仪 电泳正在进行 电泳仪 DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。 DNA分子在凝胶中移动 材料与试剂 质粒DNA DNA marker 50×TAE(电泳缓冲液) 6×凝胶加样缓冲液 琼脂糖 1%溴化乙锭溶液（EB） （注意： EB 具有毒性，戴手套操作） 实验操作步骤 胶板的制备 制备1%琼脂糖凝胶 加样 记录点样的顺序和点样量 电泳 DNA的迁移速度和电压成正比，最高的电压不超过5V/cm， DNA片段从负极向正极移动，当溴酚蓝指示剂移动到距凝胶前沿1～2cm处时，停止电泳。 实验报告 请详细记录实验过程