蒙古马运动相关候选基因的分子鉴定.pdf

摘 要 中国是世界上养马历史最悠久的国家之一，但由于机械化的普及和其它马产业 的严重滞后，马匹数量和质量发生了严重的下降。近年来，赛马和休闲骑乘在当今 世界范围内已然成为一种新兴的产业，国家对于马业重新重视，出台了相关扶持的 政策，多地开始新建赛马场和城市乘马俱乐部，并从国外引进多匹良种马。国外的 速度赛马多为纯血马，购买和饲养十分昂贵。因此，发展我国的现代马业，必须挖 掘我国本土具有优秀运动性能的马品种，通过对其运动性能的充分了解，并自主培 育我国赛马，以发展我国赛马种业。 蒙古马是世界上最古老的马品种之一，具有耐力性能卓越、抗严寒、耐粗食和 抗病力强等优良特性。并早在 13 世纪已用于赛马。伴随着分子生物学手段的进步， 国外对于纯血马在运动研究的持续开展，对我国特有的地方品种蒙古马进行运动方 面的深入详细研究，已迫在眉睫。 本研究以蒙古马为研究对象，研究了与肌肉发育和能量代谢有关基因 MSTN、 PDK4、CKM、COX411、COX412、PPARGC1A、CAV-1、FABPpm 及 LDHA 在臀中肌表达情 况；采用 PCR-SSCP 及测序的技术对表达量显著差异基因，进行多态性扫描；采用双 向电泳和质谱技术鉴定了对不同运动时期的蒙古马肌肉组织差异表达蛋白质。得到 的研究结果如下： 1.研究与肌肉发育和能量代谢有关基因 MSTN、PDK4、CKM、COX411、COX412、 PPARGC1A、CAV-1、FABPpm 及 LDHA 等在蒙古马臀中肌表达模式。 （1）研究蒙古马静止期 T 、运动刚刚结束 T 和运动后的恢复期 T 臀中肌中候 0 1 2 选基因表达情况。对上述候选基因的相对表达量进行了测定。结果显示：PDK4 和 PPARGC1A 基因，它们在耐力运动后 mRNA 的表达量都发生了上调，在运动后的恢复 期 mRNA 的表达量水平甚至还发生了显著的上调（P0.05），且二者具有显著的相关 性；蒙古马 CAV-1 基因的 mRNA 的表达量在运动后的恢复期发生了显著的上调 （P0.05），但运动刚刚结束相对运动前的静止期略有减少。 （2）对训练骑乘过的蒙古马与未曾训练的蒙古马静止状态下臀中肌中候选基因 mRNA 的表达量检测后发现，训练对蒙古马所选候选基因的mRNA 的表达量均有影响， 其中PDK4、MSTN及COX412三个基因mRNA 的表达量发生了显著的增加，特别是COX412 基因发生了极显著的增加（P0.01）。 （3）采用Western blotting 的方法对PDK4、PGC-1 和 CAV-1 蛋白在蒙古马不 同运动时期表达量进行测定，结果显示：PDK4、CAV-1 和 PGC-1 三个蛋白在耐力运 动后较运动前的静止期均有增加，且 PDK4 在运动后恢复期蛋白表达量较运动前有了 显著的增加（P0.05），而另外两个蛋白增加并未到达显著水平。 2.利用差异候选基因法，确定对在蒙古马在耐力运动前后候选基因 mRNA 的表达 量显著差异的 CAV-1，PDK4 和 PPARGC1A 三个基因为蒙古马耐力运动的候选基因，采 用 SSCP-PCR 和直接测序的方法进行基因外显子区多态研究，结果表明三个基因在蒙 古马中高度保守，仅在 PPARGC1A 第五外显子区发现单核苷酸多态。从群体遗传学的 角度分析统计了4 个品种马PPARGC1A基因第五外显子PCR-SSCP 位点的基因型频率 和等位基因频率，发现等位基因 A 比 B 占优势，AA 基因型频率比 AB 和 BB 占优 势。 3.利用双向电泳的方法对蒙古马不同运动时期骨骼肌中的蛋白质组学进行研 究，结果发现不同运动时期共有蛋白差异点 44 个，其中运动刚刚结束与运动前静止 期有 31 个差异蛋白质点，运动后恢复期与运动前静止期比较有 30 个差异蛋白点。 经 MALDI 一 TOF/MS 质谱分析，成功鉴定 44 个不同运动时期差异表达蛋白点，分值 高于 78 阈值（P0.05）的不同蛋白质有 28 个。对这些蛋白进行 GO 注释及 WEGO 分 析，结果显示：若按生物过程分，包含有 16类，其中代谢过程占 35.7%，包括ACADVL、 HSPB1、HSP70、LARS、TNNT3 和 Rab-40c 等 10 个蛋白。 关键词：蒙古马；耐力运动；骨骼肌；差异表达；