深静脉血栓形成病因学基因治疗的初步与研究.pdf

深静脉血栓形成病因学及基因治疗的初步研究 中文摘要 深静脉血栓形成病因学及基因治疗的初步研究 中文摘要 vein 研究背景深静脉血栓形成(deepthrombosis，DVT)是一种严重的，具有潜在 危险的疾病，如未得到适当治疗易发展为血栓形成后综合征、股青肿、股白肿甚至发 生肺栓塞而死亡。流行病学研究提示，深静脉血栓形成年发病率为1．60％o-1．82％o。 回顾性研究资料报道，静脉血栓栓塞症患者有高达5％．23％的死亡率，即使正规服用 抗凝剂的有症状患者，死亡率也有1％．2％。而深静脉血栓形成患者有三分之一发生 血栓形成后综合征，肺栓塞患者4％．5％发生肺动脉高压。此外，深静脉血栓形成的 治疗效果又不确切。因此，研究深静脉血栓形成的病因、发病机制和治疗至关重要。 本研究分两大部分，第一部分探讨静脉血栓形成的病因学，研究亚甲基四氢叶酸还原 酶(methylenetetrahydrofolate (methionine synthase 试图发现国人静脉血栓形成的易感因子。第二部分为静脉血栓形成基因治疗的体外实 验研究，以腺病毒介导的尿激酶型纤溶酶原激活剂(urokinase-typeplasminogen umbilicalvein activator，uPA)基因转染人脐静脉内皮细胞(humanendotheliocyte， HUVEC)，研究转uPA基因感染人脐静脉内皮细胞后的蛋白表达以及纤溶活性改变情 况，试图探讨uPA基因治疗静脉血栓形成的可行性和可能机制。 C677T和MTRRA66G基因多态性与深静脉血栓形成的关系 第一部分MTHFR 目的：研究亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolatereductase，MTHFR) 基因和蛋氨酸合成酶还原酶(methionine synthase 深静脉血栓形成的关系，探讨深静脉血栓形成的病因学。 方法：采用病例对照研究，以101例下肢深静脉血栓形成患者和同期行健康体检 的正常人群120例(对照组)的血白细胞为样本，应用等位基因序列特异性引物聚合酶 chain 链反应(polymerasereaction—sequencespecific 中文摘要 深静脉血栓形成病因学及基因治疗的初步研究 较每两组的基因型和等位基因的分布频率。同时统计下肢深静脉血栓形成的发病部 位。 脉血栓形成的发病率为83．2％。 基因A66G多态性可能不是DVT的独立遗传危险因素。下肢DVT好发于左下肢。 关键词： 亚甲基四氢叶酸还原酶；蛋氨酸合成酶还原酶；基因多态性；静脉血 栓形成 第二部分腺病毒介导uPA基因转染人脐静脉内皮细胞的体外实验研究 目的：构建含有人uPA基因的重组腺病毒载体，利用重组腺病毒载体介导人uPA 基因转染人脐静脉内皮细胞，从基因、蛋白水平检测目的基因uPA的蛋白表达和纤 溶活性，探索静脉血栓形成基因治疗的可行性和可能机制。 方法：用PCR将合成的oligo拼接成完整的uPA基因，将合成好的目的基因序 8T载体，经Xhol和Sail酶切将目的基因uPA克隆到含增强绿色荧光 列装入pMD．1 fluorescent 蛋白(Enhancedgreen Vector载体系统作为载体， uPA．IRES2．EGFP片段。采用pAD／CMV／V5．DEST Gateway 该系统是缺失了El和E3早期区的AD5型腺病毒，可容纳6--,8．5kb的外源基因， 外源基因插入到E1区。以Gateway两步重组技术重组腺病毒质粒：BP重组系统将 目的片段重组到载体pDONR22l上，LR重组系统将目的序列重组到腺病毒质粒载体 腺病毒载体。Pac