《茅山地区蝉花菌株的分离及其多糖生物活性的研究2016年论文》.pdfVIP

348 江苏农业科学 2015年第43卷第4期 司)、ALl04一IC型电子天平 (上海梅特勒 一托利多仪器有限 度，根据葡萄糖含量与吸光度回归方程计算多糖含量。 公司)、H205DR一1型高速冷冻离心机 (长沙湘仪离心机仪器 1．6 蝉花多糖抗氧化活性 有限公司)、wFZ—UV一2100型紫外可见分光光度计 (上海 1．6．1 清除DPPH 自由基能力 参照 Luo等的方法 并略 尤尼柯仪器有限公司)、无菌超净台(上海新苗医疗器械制造 有调整。称取_定量的1，1一二苯基一2一三硝基苯肼 (DP— 有限公司)、5424型台式高速离心机 (德国Eppendeff公司)、 PH)，用无水乙醇配成0．04ms／mL的DPPH溶液。分别取 JD一801M型凝胶电泳图像分析系统 (江苏捷达科技发展有 2mL不同浓度 (2、4、6、8、10mg／mL)的蝉花多糖提取液，加入 限公司)、MG96G型PCR仪(杭州朗基科学仪器有限公司)、 DPPH溶液2mL，混合均匀，室温放置 30min后 ，5000r／min GNP9270型隔水式恒温培养箱 (上海精密实验设备有限公 离心 10min。取上清液于517nm处测吸光度。用维生素C作 司)、LRH一250一Z型振荡培养箱 (韶关市泰宏医疗器械有限 阳性对照。样品中自由基清除率用下面公式计算： 公司)、DHG一9143BS型电热鼓风干燥器 (上海新苗医疗器 清除率=[1一(D。一D：)／D。]×100％。 械制造有限公司) 式中： 为2mL无水乙醇+2mLDPPH溶液的吸光度；D 1．4 蝉花菌株的分离与鉴定 为2mL样品溶液+2mLDPPH溶液的吸光度；D：为2mL样 I．4．1 组织分离 将新鲜蝉花分为菌膜、子座、菌核三部分 品溶液 +2mL无水乙醇的吸光度。 进行菌种分离。用灭菌后 的解剖刀除去表皮，各部位切成 1．6．2 总还原能力 采用Tsais等的方法 测定。在 10mL (2—3)mm×(2～3)mm的组织块，用0．1％的HgC1：溶液浸 离心管中分别加入用0．2mol／LpH值6．6的磷酸缓冲液配 泡3～4min，75％乙醇浸泡 1min进行表面消毒，无菌水漂 制的不同浓度 (2、4、6、8、10mS／mL)的蝉花多糖提取液，加入 洗，无菌滤纸吸干。置于含氨苄青霉素的PDA平板上，25℃ 1％铁氰化钾 2mL，混合均匀后于50℃反应20min。取出后 倒置培养。待组织块周边长出菌丝后，挑菌落边缘菌丝，移至 加人 10％三氯乙酸2mL终止反应，5000r／min离心 10min。 新的培养基，纯化菌株 ，获得蝉花菌株，保存备用。 取上清液2．5mL，加入2．5mL蒸馏水和0．5mLFeC1，混匀后 1．4．2 菌株的形态观察 将分离的菌株分别接种到沙氏、查 静置 10min，在700nm处测吸光度。维生素c作阳性对照。 氏和PDA培养基上，25℃培养3～4d，观察菌落颜色、大小、 1．6．3 对Fe 铁离子螯合能力 参考 Decker等的方法 形状及边缘形状。在显微镜下观察菌丝有无隔，分生孢子梗， 并略有调整。分别取3mL不同浓度 (2、4、6、8、10ms／mL)的 分生孢子大小、形状等。 蝉花多糖提取液，加入 2mmol／L的FeC1溶液 0．05mL和 1．4．3 菌株的分子鉴定 采用Ezup柱式真菌基因组DNA 5mmol／L的菲洛嗪溶液，剧烈振荡后室温放置 10min，于 抽提试剂盒，对在 PDA液体培养基上培养4d的菌丝球抽提 562nm处测吸光度。EDTA为阳性对照。样品对 Fe 的螯 基因组 DNA，采用真菌 ITS区扩增通用引物。(ITS1：TCCG— 合率计算公式如下： TAGGTGAACCTGCGG，ITS2：TCCTCCGCTTATFGATATGC)对 螯合率=[D0一(D 一D：)]／D。×。100％。 核糖体转录间隔区ITS进行 PCR扩增 ，扩增条件为：94℃预 式中：D。为3mL蒸馏水代替反应体系中样品溶液后的吸光