携带抗血管生成因的肿瘤靶向性溶瘤腺病毒的抗肿瘤作用研究.pdf

三、实验结果………………………………………………………………………32 四、讨论……………………………………………………………………………………………………37 第4章溶瘤腺病毒治疗肿瘤的体外研究和体内实验………………………………．．39 一、实验材料和试剂………………………………………………………………39 二、实验方法………………………………………………………………………40 三、实验结果………………………………………………………………………43 四、讨论……………………………………………………………………………………………………50 第5章突变型E1A基因的功能研究………………………………………………………。52 一、实验材料和试剂………………………………………………………………52 二、实验方法………………………………………………………………………53 三、实验结果……………………………………………………………………。55 四、讨论…………………．………………………………………………………………………………。60 全文小结………………………………………………………………………………………………．62 附录主要仪器设备…………。…。…．．．…………………………………………………63 参考文献……………………………………………………………………………………………………64 在读期间发表的学术论文及研究成果……．．．．．．……………．．．…………………………………74 致 谢……．．…．．…．．．…．．…………．…．……．．．．．．．…．．．．………………．．…．．．．…．．．．．．．．．．……．．…………75 摘要 摘要 基因治疗是将正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞 或组织中以治疗疾病，例如遗传疾病中用有功能的基因替代缺失突变的等位基 因。尽管该技术刚起步不久，已经取得了一些成功。科学技术的突破将继续推动 基因治疗成为主要的医学技术。现今，大部分的基因治疗研究集中于有遗传缺陷 的疾病和癌症。基因治疗有2种类型：生殖细胞的基因治疗和体细胞的基因治疗。 目前更多地是采用体细胞基因治疗。基因治疗的关键是基于外源基因在目的细胞 中高效稳定的表达，这在很大程度上取决于基因治疗采用的载体系统。 在基因治疗技术中，腺病毒载体与其他载体系统相比较而言，有宿主范围广、 感染率高、理化性质稳定等特点，而且由于腺病毒的非整合性使之不会整合到宿 主基因组中，保证了较高的生物安全性，故现在常用于基因治疗。端粒酶与肿瘤 无限增殖的特性有关，在85％以上的肿瘤细胞中端粒酶为阳性。端粒酶的激活 是癌症发生的关键步骤。它的激活和端粒酶逆转录酶(TERT)表达密切相关，表 达端粒酶活性的肿瘤细胞能够激活端粒酶逆转录酶启动子。人表皮生长因子受体 2(Her2／Neu)是乳腺癌及其他癌症的潜在癌蛋白，在很多的肿瘤细胞中过表达， 因此Her2基因已经成为癌症基因治疗的靶点。越来越多的证据表明，实体瘤和 它们的转移是血管生成依赖性的。抗血管生成治疗可以阻止肿瘤周围新生血管的 形成，从而破坏滋养肿瘤块的不正常的毛细血管网络系统。人内皮抑素(human 蛋白(胶原XⅧ)羧基末端片段水解而来。内皮抑素是特异性的血管内皮细胞生长 抑制因子，能显著抑制肿瘤血管增生并诱导肿瘤细胞凋亡。内皮抑素的抗血管生 成治疗和血管靶向基因治疗，为治疗实体瘤提供了广阔前景。 本研究针对肿瘤细胞高表达TERT、高表达Her2、新生血管生成三大肿瘤特 征，构建了肿瘤特异性溶瘤腺病毒，对其体外及体内的抗肿瘤作用进行了研究， 同时研究了腺病毒关键基因E1A的功能，主要取得以下结果： 1．采用荧光素酶报告基因检测系统，证明人端粒酶逆转录酶启动子(hTERTp) 和人表皮生长因子2(Her2／neu)基因增强子构成的嵌合型重组子在端粒酶表达 阳性的肿瘤细胞中有很高的转录活性。 2．构建了由人端粒酶逆转录酶启动子(hTERT)和人表皮生长因子受体2增 摘要 方法检测了病毒的感染能力。 3．通过体内及体外实验，探究溶瘤腺病毒的抗肿瘤效果。报告基因EGFP 的表达显示了腺病毒在肿瘤细胞中的高效感染率：病毒增殖和细胞活力检测实验 证实溶瘤腺病毒的体外抗肿瘤作用，western免疫印迹显示了关键蛋白(E1A和