运用2d-die技术研究黄瓜果实特异性启动子和拟南芥br信号转导.pdf

摘要 摘要 启动子是调控基因时空表达的重要元件，是基因表达调控和基因工程研究 的重要内容之一。为了获得在黄瓜果实特异性表达的启动子，本研究采用2D． DIGE的方法分析了黄瓜果实、茎和叶的可溶性总蛋白质并发现了一个在黄瓜果 实高表达而在茎和叶中基本不表达的蛋白点，通过Edman降解法测序获得了其 ofeDNA 根据获得的氨基酸序列通过3’．和5-RACE(RapidAmplification Ends)的方法克隆了该基因的全长eDNA片段。该基因编码长度为220氨基酸的 蛋白质，同源性比对表明该基因编码的蛋白质与细菌、拟南芥、烟草及菠菜中 的2，4．二氢喋啶合酶(1umazine sativuslumazine 该基因命名为黄瓜2，4．二氢喋啶合酶(Cucumis synthase，简称 析，结果表明。工IS在黄瓜果实中的表达量远远高于茎或叶，从而证实了2D． 2．1kb的启动子序列并用GUS组织化学染色的方 个外显子。同时克隆了CsLS 法分析了该启动子的活性，结果表明CsLS启动子可以驱动GUS基因在黄瓜果 实的高表达，而在茎和叶中未发现明显的表达。 育的各个时期都发挥着重要作用。拟南芥BR信号转导研究目前已取得了极大 的进展，众多信号分子包括受体BRll、共受体BAKl、下游激酶BSKs、磷酸 活标签等方法得到了鉴定并对其在BR信号途径的作用进行了详细的研究。尽 管如此，对于BR信号途径的了解仍然远远不够。本研究用2D．DIGE技术对拟 南芥暗生长条件下受BR调节的早期反应质膜蛋白进行了分析，并通过LC． MS／MS的方法鉴定了15个蛋白点，这些蛋白点分别对应10个不同的受BL上 证，表明PP2A确实是在质膜上受BR下调的早期反应蛋白质。 BZRl是油菜素内酯信号转导途径的转录因子，控制BR调节基因的表 达。BZRl的功能受磷酸化的调节。当胞外BR浓度较低时，BIN2磷酸化 摘要 合，滞留在胞质中，并且促进BZRl的降解。当胞外BR浓度升高时，质膜上 化，进入细胞核中结合DNA，调节基因的表达。在此过程中，细胞内哪一种磷 酸酶将磷酸化的BZRl去磷酸化还不清楚。 为了分析PP2A是否是去磷酸化BZRl的磷酸酶，本研究首先对PP2A与 BZRl的相互作用进行了分析。PP2A包括A、B和C三个亚基。其中A亚基起 脚手架的作用，C亚基为催化亚基，B亚基则决定了PP2A催化底物的特异性 及亚细胞定位。免疫共沉淀结果表明PP2AA亚基和C亚基与BZRl或bzrl．1D 在拟南芥植物体内处于同一个蛋白质复合体中。拟南芥PP2AB亚基包括B、 B’、B”三个不同的亚基家族。酵母双杂交分析表明PP2AB和B亚基家族成员 不能与BZRl相互作用，而PP2AB’OL、B’13、B’丫、B’11、B’0、B’‘和B7K能与 BZRl以及BZRl功能获得性突变体bzrl．1D蛋白相互作用，PP2AB76则仅与 bzrl．1D相互作用，而PP2AB7￡则与两者都不相互作用。凝胶孵育免疫杂交表 明，PP2A BZRl结合力更强。这和酶与最佳底物结合能力最强的原理十分吻合。 过表达PP2A 行的位置，且其功能依赖于受体BRll。同时过表达PP2A B’Or,和B’13都可以回 B’Or． 复突变体bril一5中BR信号转导标记基因CPD的表达水平，但是与PP2A 相比，PP2A B’0【和B’13提高 B7D的恢复能力更强一些。在野生型中过表达PP2A 植物对BR生物合成抑制剂BRZ的抗性。PP2AT．DNA敲除降低拟南芥对 B’13 BL的敏感性；PP2A 性。所有这些结果表明PP2