黄颡黄生殖相关因的克隆、表达及对温度的响应.pdf

黄颡鱼生殖相关基因基因的克隆、表达及对热应淑碹响应 黄颡鱼生殖棺关基因的克隆、表达及对温度的响应 摘 要 本论文以雌性黄颡鱼为研究对象，运用组织学、内分泌学方法和分子生物学 方法，克隆了与其生殖相关的促性腺激素受体、P450c17I、芳香化酶和Sox9基因， 并对时空表达和热应激响应进行了研究和分析。 l促性腺激素受体基因克隆与在雌鱼生殖周期中的表达 受体(磁凇)和促黄体激素受体陋凇)cDNA全长序列。其中翮全长2340bp， 编码661aa，删R全长2524 bp，编码701aa，均具有G蛋白偶联受体超家族(G prot血．coupled killaSe 在的N．端糖基化位点；位于第一个包外环的蛋白激酶C(proteinC，PKC) 磷酸化位点(403Y)；并且在C．末端(C．te肌inaldomajn)G蛋白偶联区域，发现 中发现4个潜在的N．端糖基化位点；24个Ser，6个nlr和5个研磷酸化位点； 他组织中少量或微量的表达；在卵巢发育周期中， 砌在卵巢表达从IⅡ期．Ⅳ 期处于较高水平，脑中在Ⅵ期达到最高值。推测脚参与卵母细胞成熟及卵黄 蛋白的积累。同时发现删R在卵巢中大量表达，其次是脑、肾脏、心脏、肝脏 和肠；在卵巢繁殖周期中，删R在卵巢表达从ⅡI期．V期处于表达水平较高，V 期达到最高峰，随后下降到最低值；而脑中的表达高峰出现在Ⅳ期，与血浆中 E2变化水平相一致。推测卵巢和脑中口豫参与卵黄蛋白的生成，调控卵母细胞 的成熟以及参与排卵。 2黄颡鱼P450c17．IcDNA克隆，雌鱼时空表达和热应激表达分析 的合成过程中起重要的调控作用。通过RT-PCR和SmaItrMRace技术，我们克 cDNA全长2071 隆得到了黄颡鱼P450c17一I bp，共编码514砸，现已提交GenBank 01_’s 十三肽区和细胞色素P450半胱氨酸血镶红素配体信号区j1四个典型的P450C17．I 黄颡鱼生殖相关基因基因的克隆、表达及对热应激的响应 特异性保守区域。通过半定量RT-PCR技术分析P450c17．I基因的时空表达发现， CyPJ『¨在卵巢和头肾的表达量最高，其次分别为脑、肝脏和胃，而在肾脏、鳃一 和脾脏中发现极为微弱的表达。在周期表达中发现，卵巢中CyPJ硝的变化趋势 与T相似。在卵巢成熟期达到峰值，随后显著性降低。而脑中的表达趋势同卵巢 趋势相反，C卯J硝表达的最低值出现在V期。在热应激表达中，除卵巢发育Ⅵ 期，C印J70与睾酮的含量变化相一致，而脑中的变化趋势没有相关性。说明 C冲JM在卵母细胞发育和成熟期间对类固醇激素生成起到了关键的调控作用。 3细胞色素P450芳香化酶在雌性黄颡鱼在卵巢发育周期和热应激条 件下的表达模式 本实验主要研究了在雌性黄颡鱼繁殖周期中起关键作用的两种P450芳香化 酶。从组织的差异性表达发现C阡J妨主要在脑和卵巢中大量表达，其中脑中的 ‘ 表达高于卵巢，而且在肠中也发现C印』她的表达。C印J姐只在卵巢的存在特 异性表达。利用半定量RT-PCR的方法分析发现在性腺发育周期中均存在较高的 转录水平，且其表达模式与血浆E2水平相似。在每一卵巢发育阶段热应激表达 实验中，我们发现在V期和II期热应激对两种亚型的表达，血浆E2和T的含量 具有上调作用，从而促进卵母细胞的成熟、排卵和卵巢的再发育。在卵巢发育ⅡI 期阶段中，热应激则起到下调作用，可能参与抑制卵黄卵母细胞的发育。实验表 明：两种芳香化酶亚型的表达与血浆E2和T水平存在的密切的联系，说明C印J9 在卵巢发育周期中具有重要的作用，且热应激能够影响繁殖周期中卵巢的发育。 P450拍m将是研究黄颡鱼生理功能的重要的候补基因。 4Sox9基因在黄颡鱼卵巢发育周期的表达及对热应激的响应 本文采用半定量PCR的方法，分别从时空表达，温度应激调控和血清雌二 表明：鼢勉J在雌性黄颡鱼各组织中存在广泛的表达，而鼢勉2则在脑和卵巢 中有高表达(脑卵巢)，胃中表达微弱。在卵巢年周期发育中，卵巢中鼢妃J『