黑青斑河鲀干扰γ及其受体的克隆鉴定和配体重组蛋白活性研究.pdf

IFN?是唯一的II型干扰素，它作为宿主受感染前期分泌的“危险”信号分子， 能快速警告邻近的细胞和先天性免疫的效应细胞，参与到先天性和获得性免疫反 应的起始阶段。本报告通过比较基因组学方法结合分子生物学手段，首次从黑青 斑河纯中克隆得到两种干扰素丫(IFNy)和及其受体结合亚基(IFNGRl)两种 ● 亚型的开放读码框序列；通过生物信息学软件分析，了解黑青斑河纯IFN),及 IFNGRI与其他脊椎动物同源基因的结构异同及进化关系：使用半定量RT-PCR 技术分析IFN／和IFNGRI在黑青斑河鲍鱼体各组织的表达情况；使用原核蛋白 表达系统，表达和纯化了黑青斑河纯两种IFN),重组蛋白，并利用Western杂交 鉴定得到的蛋白；最后，使用黑青斑河纯两种IFNT重组蛋白离体孵育免疫细胞， 检测重组IFN7蛋白对头肾细胞下游基因表达量的影响。主要研究结果如下： 同源基因具有相似的长度和分子量。黑青斑河纯两种In¨与其他鱼类IFN),相 C-端带有 似，都具有N．端信号肽序列和C．端IFN),家族标识序列。此外，IFN72 类似哺乳动物IFNy的核定位序列。黑青斑河纯IFN7受体结合亚基IFNGRl两 种亚型则均为单次跨膜受体，在胞外区有多个保守的半胱氨酸残基，胞内区有 JAKl结合位点和STATI停泊位点。 与其他脊椎动物IFNy及IFNGRl氨基酸序列同源性分析和进化树分析发现， 黑青斑河纯IFN7和IFNGRl与红鳍东方鲢同源基因亲缘关系最近，与哺乳动物 进化关系最远。RT-PCR分析黑青斑河纯两种IFNT和两种IFNGRl基因在鱼体 各组织的表达模式，结果显示两种In唧表达模式差异较大，两种IFNGRl表达 模式差异较小。 2．本研究构建了黑青斑河纯IFN),I和IFNlt2成熟肽的原核表达载体，转化 并得到重组表达工程菌株，通过对诱导的时间、温度和IPTG浓度的优化，选择 以30。C为诱导温度，0．3 mM(In叶1)和0．5mM(IFNy2)IPTG为诱导浓度， 诱导7小时后获得高产量的IFNt2重组可溶蛋白和IFNTl重组蛋白包涵体。以 抗组氨酸标签的单抗为一抗的Wcstem杂交鉴定纯化和脱盐后的重组蛋白确为 黑青斑河纯两种IFNy重组蛋白。进一步对包涵体IFNyl进行了纯化、变性和复 性及对IFNy2进行纯化，得到了黑青斑河纯两种IFNT重组蛋白。 3．通过离体孵育和荧光定量PCR技术检测，发现在黑青斑河纯头肾细胞 中，lng／ml和10ng／ml的重组IFNl,1以及10ng／ml的重组IFNv2蛋白孵育头肾 细胞4小时后均能显著上调ISGl5mRNA水平；对于I型IFN的标志性因子 MX基因，与其他物种II型IFN同源性较高的IFNv2重组蛋白对该基因无显著 性影响，但鱼类所特有的IFN7l各浓度均能显著性抑制MX基因的表达，表明 白具有其特定的生物学活性，既表现出与之前鱼类研究的IFNt相同的特点，又 显示出一定的功能差异。 关键词：黑青斑河鲍，干扰素丫，干扰素丫受体，表达模式，功能研究 Ⅱ 嬲aThl Itdrives antiviral proteins， Tcell and differentiation,mediatesleukocyte regulatesproliferation trafficking，and have enhances clonedtheORFsoftwo antigenpresentation．Herein，we