实验3质粒DNA的提取.pptVIP

一、实验目的与背景 掌握碱裂解法提取质粒的原理 学习和掌握碱裂解法提取质粒的技术 碱裂解法提取原理 （78页） 碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离 当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不复性而呈絮状，离心时可沉淀下来 三、仪器、材料与试剂 恒温培养箱 恒温摇床 台式离心机 高压灭菌锅 移液枪 含R-pGEX-4T-1质粒的大肠杆菌 含氨苄青霉素的LB液体培养基 溶液Ⅰ、溶液Ⅱ和溶液Ⅲ 70％乙醇 胰RNA酶 平衡酚 四、实验步骤 1. 将25mL含氨苄青霉素（100μg/mL）的LB液体培养基加入100mL锥形瓶中，接入含R-pGEX-4T-1质粒的大肠杆菌，37℃振荡培养过夜 2. 收菌，吸取1.5mL培养物加入1.5mL离心管中，4000r/min室温离心2min 3. 小心吸去培养液，将管倒置于卫生纸上数分钟,使液体流尽(细菌沉淀尽可能干燥) 4. 将细菌沉淀悬浮于100μL溶液Ⅰ中，充分混匀(涡旋振荡)，室温放置10min 5. 加入200μL溶液Ⅱ（新鲜配制），盖紧盖子，快速温和颠倒离心管数次,以混匀内容物 (千万不要振荡),冰浴5分钟 6. 加入150μL溶液Ⅲ（冰上预冷），盖紧