植物基因组DNA的提取及分析.docVIP

CTAB法提取植物基因组DNA原理 这种方法是由Murray 和Thompson（1980）修改而成的简便方法。CTAB是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（（0.7 mol/L NaCl）是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定程度（0.3 mol/L NaCl）时，从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB-核酸的复合物与蛋白、多糖类物质分开。最后通过乙醇或异丙醇沉淀DNA，而CTAB溶于乙醇或异丙醇而除去。 (1) 2×CTAB溶液 CTAB（W/V） 2% Tris-HCl 100mmol/L（pH8.0） EDTA 20mmol/L （pH8.0） NaCl 1.4mol/L PVP 1% 灭菌备用。没灭菌前呈粘稠状 ，CTAB灭菌后变成清亮的溶液。 (2) 氯仿/异戊醇（24:1） (3) RNaseA 10mg/ml(不用) (4)乙醇或异丙醇 (5)β-巯基乙醇 (6) 70%乙醇 操作程序 1． 在2mL离心管中，加入500μl的2×CTAB, 65℃预热，用前加入20 μl β-巯基乙醇。 2． 嫩的组织材料1-2g,用蒸馏水冲洗干净，再用灭菌ddH2O冲洗2次，放入经液氮预冷的研钵中，加入液氮研磨至粉末状，用干净的灭菌不锈钢勺转移粉末到预热的离心管中，总体积达到1mL混匀后置65℃水浴中保温45-60min，并不时轻轻转动试管。 注：冻存材料直接研磨，绝对不能化冻。而且粉末应在化冻前转移，否则内源性DNase有可能降解基因组DNA。 3．加等体积的氯仿/异戊醇，轻轻地颠倒混匀，室温下10 000rpm离心10 min，移上清至另一新管中。 4．加入2倍体积的100%乙醇或0.7倍体积异丙醇，会出现絮状沉淀，-20℃放置30 min或-80℃放置10min，12 000rpm离心10-15min回收DNA沉淀。 5．用70%乙醇清洗沉淀两次，吹干后溶于适量的灭菌ddH2O或TE 缓冲液中 6．0.8%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的完整性。 电泳分析基因组DNA的完整性 可能出现的问题及解决方案 1.如果DNA沉淀呈白色透明状而且溶解后成粘稠状，说明DNA含有较多的多糖类物质，可以在取材前将植物放暗处24hr，以达到去除淀粉的目的。 2.如果DNA沉淀呈棕色，难以用限制性内切酶完全消化 植物材料含有大量酚类化合物，与DNA共价结合，使DNA呈棕色，并抑制DNA的酶解反应。为防止此情况出现，可在加入2 ×CTAB的同时加入2-5%的巯基乙醇，或者加入亚精胺(100μl DNA加5μl 0.1mol/L的亚精胺）。 3.DNA中含有多糖或盐类 将DNA用100%乙醇或异丙醇沉淀出来，离心，沉淀用70%乙醇清洗两次或更多次，吹干后重溶于TE中。（注意乙醇一定要吹干, 否则电泳点样时, 样品上漂） 4.DNA已降解电泳条带呈弥散状 样品降解可能有两种情况：一是机械振动过剧烈，二是操作过程中DNase污染。在提取DNA的各个操作过程中要避免剧烈振荡，提取液及用品要高温高压灭菌。另外，使用吸头吸取过程中应避免产生气泡，吸头应剪去尖部，避免反复冻融DNA。 烟草基因组DNA电泳图谱 M: (DNA/ HindⅢ Marker 1，2 :基因组DNA 完整性好的基因组DNA应是一条比23Kb滞后的电泳带, 若降解则成为弥散状。 电泳前缘为未除干净的RNA。