实验3质粒DNA的提取与鉴定.pptVIP

影响酶切反应的因素 底物DNA的纯度：主要污染DNA 的某些物质，如酚、氯仿、乙醇等均能抑制酶反应; 反应系统：主要是反应缓冲液中的离子强度,如NaCl和Mg2+, 合适离子强度可以激发酶切反应; 反应体积：一般应尽量小，且酶切反应中甘油浓度应低于5%; 保温时间与温度：温度改变会使酶识别错误; 限制性内切酶 紫外光吸收法 原理：1,物质在光的照射下会产生对光的吸收效应 2,而且物质对光的吸收是具有选择性的 3,各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱 因此不同波长的单色光通过溶液时其光的能量就会被不同程度的吸收，光能量被吸收的程度和物质的浓度有一定的比例关系. 定量检测 计算方法: 因为组成核酸的碱基(G,A,T,C）在260nm处具有强吸收峰，所以通过测定260nm的吸收峰即可对DNA进行定量。 dsDNA(双链DNA) 1OD260 = 50ug/ml ssDNA(单链DNA) 1OD260 = 33ug/ml RNA 1OD260 = 40ug/ml 定量检测 记录OD260值，通过计算确定DNA浓度，公式如下: 质粒DNA(?g /ml)=50×(OD260) × 稀释倍数 注意:我们接下来要用的eppendorf公司生产的紫外分光光度计,会根据样品的稀释倍数自动算出质粒DNA的最终浓度和Ratio值. 定量检测 根据在260nm以及在280nm的读数比值估计核酸的纯度（Ratio=A260/A280） Ratio= 1.8 DNA样品较纯,符合实验要求 Ratio＞1.9 RNA污染 Ratio＜1.6 有蛋白质或其它杂质的污染 定量检测 实验仪器 定量检测 紫外分光光度计 比色杯 数据处理 测量次数 质粒DNA浓度 (μg/ml) Ratio值 (A260/A280) 1 2 3 平均值 定量检测 菌体老化 碱裂解不充分 菌体中无质粒 溶液使用不当 请涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养 可减少菌体用量或增加溶液的用量 不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。检查抗生素使用浓度是否正确。 溶液Ⅱ在温度较低时可能出现浑浊，置于37℃保温片刻直至溶解为清亮的溶液。 问题一：未提出质粒或质粒得率较低，如何解决？ 原 因 对 策 常见问题 混有蛋白 混有RNA 混有基因组DNA 不要使用过多菌体。重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质 加入RNaseA室温放置一段时间 加入溶液II 和III后防止剧烈振荡，可能把基因组DNA剪切成碎片从而混杂在质粒中。细菌培养时间过长会导致细胞和DNA的降解，培养时间不要超过16小时。 问题二：质粒纯度不高，如何解决？ 原因 对 策 常见问题 定量检测 第三部分 琼脂糖凝胶电泳 DNA Agarose Gel Electrophoresis 天然琼脂（Agar）是一种多聚糖，主要由琼脂糖（Agarose ，约占80％）及琼脂胶（Agaropectin）组成。 琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷。 琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象，加之硫酸根可与某些蛋白质作用而影响电泳速度及分离效果。琼脂糖透明无紫外吸收，因此，目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳。 定 义 * 底物DNA的纯度：主要污染DNA 的某些物质，如酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS及高浓度NaCl等均能抑制酶反应 反应系统：反应缓冲液的主要成分是Tris-Cl、NaCl和Mg2+,离子强度合适可以激发酶切反应，反之会抑制甚至导致酶识别活性的丧失。 反应体积：一般应尽量小，但由于酶的储存液是在50%甘油中，甘油会使很多酶的识别特异性下降，故酶切反应中甘油浓度应低于5% 保温时间与温度：温度改变会使酶识别错误，延长酶切时间可使所需酶量减少。 * 电泳是分离和纯化DNA片段的最常用技术 * 核酸为两性分子,在pH3.5时，整个分子带正电,pH8左右时，碱基几乎不解离，整个分子带负电。 质粒DNA的提取、定量酶切与鉴定 /sfzx/ 南方医科大学 生物化学与分子生物学实验教学中心 Expertimental Teaching Center of Biochemistry and Molecular Biology 尹莉 E-mail:qsdyl_2006@163.com 实验内容 提取原理 操作步骤 计算方法 操作步骤 质粒DNA 定量 酶切原理 酶切步骤 酶切 电泳原理 电泳步骤 电泳 实验目的 掌握碱裂解