犬传染性肝炎核酸疫苗免疫效果的研究.pdfVIP

中文摘要 方法 1用碱裂解法大量提取真核重组质粒 取真核重组质粒阳性克隆重组菌接种于2xYT液体培养 基振荡摇培养36h；离心收集细菌沉淀。采用SDS一碱裂解法 pVAXl．CpG-Loop进行纯度和浓度测定。 2免疫动物 6．8周龄雌性BALB／c小鼠随机分为7组各5只：①肌注A 组：小鼠左右股四头肌预先注射25％的灭菌蔗糖溶液共 100汕g／只；②肌注B组：25％的灭菌蔗糖溶液注射同前，小鼠 pVAXl-CpG-Loop100I_,g／只，最后一次用抗原重组蛋白加强 免疫；④联合免疫组：采用肌肉注射、皮下注射及鼻粘膜滴 注的联合免疫方法，共2001-lg／只／次；⑤电转染A组：小鼠股 四头肌注射重组质粒pVAXl一CpG-Loop100I,g／只，注射后在 染B组；小鼠股四头肌电转染注射重组质粒 loopg／只(最后一次用抗原重组蛋白加强 pVAXl一CpG—Loop 免疫)，电击方法同上；⑦空载体pVAXI．CpG对照组：股四 头肌注射空载体pVAXl-CpG 共免疫3次。 3免疫动物的免疫效果评价 ELISA测定血清抗体效价免疫后每周断尾采血，分离 血清，以犬传染性肝炎病毒抗原每孔100I_tg／ml包被酶标板，4 中文摘要 492nm波长处测吸光度值。 T淋巴细胞亚群分类 免疫3次后的小鼠放血致死，用 200目铜网无菌分离脾淋巴细胞，细胞用含10％胎牛血清的 X106／1111，加入荧光标记的 DMEM培养液重悬，调细胞数为1 抗体，用流式细胞仪检测。 小鼠的T淋巴细胞增殖活性。 淋巴细胞诱生因子的检测取5X106／ml的脾淋巴细胞 Y的浓度。 中和试验收集各组小鼠血清，灭活后采用固定病毒一 稀释血清法进行微量中和实验。 结果 双酶切和1．2％琼脂糖凝胶电泳鉴定，显示860bp左右的电 泳条带。所得重组质粒经分光光度计进行纯度和浓度测定， OD260／OD2so大约在1．8-2．0之间。 案免疫小鼠后，间接ELISA检测显示，重组质粒 病毒发生免疫结合反应；各实验组小鼠所产生的抗体效价明 合免疫明显高于其它实验组(Po．05)。免疫小鼠脾淋巴细 胞经流式细胞分析，各实验组小鼠CD4+T细胞和CDs+T细 中文摘要 用MTF和CCK-8法检测脾淋巴细胞增殖活性，得到的结论 是一致的。结果显示：①各免疫组小鼠脾淋巴细胞增殖活性 高于电转A组，差异有显著统计学意义(P0．05)；肌肉注 异(P0．05)；③相同免疫方案和免疫途径，不同免疫剂量 比较：肌肉注射B组(200,g／只)明显高于肌肉注射A组 免疫途径比较，均无显著统计学差异。经定量ELISA试剂 盒检测免疫小鼠脾淋巴细胞诱生的IFN-Y含量，结果显示 组(P0．05)。 3血清微量中和试验结果显示：各实验组小鼠血清中均 可检测到中和抗体，最高效价为I：8。 结论 原病毒的特异性kG抗体，且联合免疫组的抗体水平明显 诱导小鼠产生了体液免疫应答，多种途径联合免疫可有效地 增强DNA疫苗诱导的体液免疫应答。流式细胞分析显示各 实验组小鼠的T淋巴细胞亚群的构成比均高于空载体 组小鼠脾脏的淋巴细胞增殖活性，实验组小鼠淋巴细胞增殖 中文摘要 测各免疫组小鼠脾淋巴细胞培养上清IFN-g的分泌情况， 实验组小鼠明显高于空载体pVAXl-CpG对照组；以上结果 异性的体液免疫应答，也诱导小鼠产生了细胞免疫应答。 疫小鼠，诱导小鼠产生具有抑制病毒感染细胞的中和抗体， 位的存在，具有免疫保护作用。 关键词：犬传染性肝炎；核酸疫苗；重组质粒；免疫 效果评价；中和抗体 英文摘要 AcidVaccine EffectofImmuneonNucleic Efficacy ofCanineInfectious