DNA测序常见问题分析及解决办法.pptVIP

中美泰和生物技术（北京）有限公司 主讲人：朱传伟 一、染料峰 辨识要点：一般染料峰出现在200bp以内，图谱被抬高，对测序结果的判读有一定影响，此区域的QV值一般比较低。测序信号偏低时，染料峰比较容易出现。 原 因：纯化实验时，染料去除不彻底。 解决方法：重新安排测序反应 二、酒精峰 辨识要点：酒精峰一般出现在200-300bp之间，基本上不影 响测序结果的判读，但此区域的QV值一般偏低。 三、双克隆引起的套峰 辨识要点：左边清晰干净，右边全部双峰；raw data中左边峰高比右边高一倍。但对于部分样品，也可能只是序列中一段出现双峰，两边序列是好的。 原 因：挑克隆时两个质粒混在一起；两个质粒使用同样的载体。如果是一个质粒中混有少量同样载体的 其他质粒，则峰图类似于“4 Repeats 图A”。 解决方法：重新挑单克隆，重新提取质粒 四、杂合子引起的套峰 辨识要点：左边清晰干净，右边全部双峰，且双峰处两种碱基的峰高基本一致，如图A；反向测序结果如图B，也是左边清晰干净，右边全部双峰；而同批次其他PCR的测序结果，峰图干净无双峰现象，如图C。 原 因： ① 通过图A与图B、或与图C的峰图序列进行比对，可以发现图A为杂合子，一套染色体正常，另一套染色体DNA在87bp的位置缺失一个碱基A（而在图B中为在232bp处缺失一个碱基T）。另，碱基插入也会引起同样的现象。 ② 两套染色体是1:1的关系，故每套染色体DNA产生的峰值也是1：1，反应在峰图上为峰高一样高。 解决方法：进行反向测序，通过正反向测序峰图比较，推断出碱基的缺失或插入 五、重复序列引起的套峰 辨识要点：从峰图上看，与双克隆、杂合子的峰图类似，关键的辨识是要对测序部分的DNA序列有充分的了解。 原 因：引物有2个结合位点。（上图为M13F(-47)的测序结果，它的3’前10个碱基还能与插入DNA序列的215-224处结合，导致测序出现套峰现象） 解决方法：选用特异性引物测序 重复序列引起的套峰 辨识要点：从峰图上看，与双克隆、杂合子的峰图类似，关键的辨识是要对测序部分的DNA序列有充分的了解。 原 因：引物的结合位点在重复序列内，即引物有多个重复序列。 解决方法：选用特异性引物测序 重复序列引起的套峰 3、长串类似碱基的重复（引物在重复序列外） 七、主峰前面都有一个小“肩膀” 辨识要点：每个主峰前面都有一个小“肩膀”，且小“肩膀”的峰与主峰的颜色一致，这显然是后面的碱基向前移了一个。 原 因：① 引物降解引起，由于引物降解是从5’开始的，少量引物的降解，会导致轻微的移码现象，这不影响主峰的判读，如果引物降解严重，会出现比较严重的套峰现象，将无法判读。 ② 引物合成时部分引物少合成了1个碱基，正常的引物和缺一个碱基的引物混在一起。 解决方法：更换新的引物，或重新合成引物 八、主峰后面都有一个小“肩膀” 辨识要点： 每个主峰后面都有一个小“肩膀”，且小“肩膀”的峰与主峰的颜色一致，这显然是前面的碱基向后移了一个。 原 因： 引物合成时部分引物多合成了1个碱基，正常的引物和多一个碱基的引物混在一起。 解决方法： 更换新的引物，或重新合成引物。 九、PolyA/T/ G/ C 辨识要点：一长串的连续A/T/C/G单个碱基的重复，一般polyA/T结构后伴有移码现象，峰形会变乱，PolyC/G结构后信号容易中断，但有时也可以测过PolyN结构。 解决方法：反向测序 十、高级结构导致的信号中断或衰减 对应的raw data图： 4. hairpin structure 对应的raw data如下： 辨识要点：开始峰形是好的，从某一点或某一区域开始峰形突然变乱或中断，raw data显示为信号突然降低或中断。一般AG rich region、TG rich region、GC rich region、G or C rich region等高级结构，从峰图上都比较好辨别，而hairpin structure往往不好分析。 原 因：一般序列中含有hairpin structure、AG rich region、TG rich region、GC rich region、G or C rich region等高级结构，会导致信号迅速衰减或中断。 解决方法：反向测序，或优化测序条件 十一、两个终止峰 辨识要点：PCR产物测序终止处有2个明显的A终止峰，一般会导致测序峰图变乱或干扰峰 原 因：PCR产物不纯，有非特异条带，且条带大小相近，用一般的琼脂糖电泳很难分开。 解决方法