《两个苹果乙烯反应因子MdAP2D4与MdAP2D19的序列分析及原核表达》.pdfVIP

中国农业科学 2013，46(17)：3635—3642 ScientiaAgriculturaSinica doi：10．38648．issn．0578—1752．2013．17．012 两个苹果乙烯反应因子 MdAP2D4与MdAP2D19的 序列分析及原核表达 田 义 ，陈可钦 ，安秀红 ，郝红梅 ，刘 志 ，丛佩华 ，郝玉金 (山东农业大学园艺科学与工程学院／作物生物学国家重点实验室，山东泰安271018； 中国农业科学院果树研究所／农业部园艺作物种质资源利用 重点实验室，辽宁兴城 125100； 辽宁省果树科学研究所，辽宁熊岳 115009) 摘要：【目的】克隆苹果中的两个 ERF(ethyleneresponsivefactor)转录因子，对其序列与表达进行分析； 并进一步构建原核表达载体，在大肠杆菌中诱导融合蛋 白表达，为解析两基因的抗病功能及作用机制奠定基础。 【方法】首先，将抑制性消减杂交筛选到的EST序列进行BLAST比对，根据比对获得的MdAP2D4与MdAP2D19的 cDNA序列设计引物进行克隆；然后，利用MEGA4．1软件将两个ERF蛋白与拟南芥的AP2家族蛋白进行聚类分析， 对保守的AP2功能域的氨基酸序列进行分析；并进一步利用RT—PCR检测两基因对外源MeJA的响应；最后，将两 个基因分别连接到原核表达载体 卜』上，利用 IPTG对转化的大肠杆菌BL21进行诱导。【结果】MdAP2D4与 MdAP2D19两个基因均与拟南芥B3组ERF亲缘关系最近，在叶片中表达较高，都能被外源的MeJA诱导表达。SDS 检测结果表明，两个基因的融合蛋白均能够被 IPTG诱导表达。【结论】MdAP2D4与MdAP2D19为 B3组ERF转录因 子，外源MeJA能够诱导其表达 关键词：抑制性消减杂交；茉莉酸甲酯；乙烯反应因子；原核表达；抗病性 SequenceAnalysisandProkaryoticExpressionofTwoEthylene ResponsiveFactorsMdAP2D4andMdAP2D19 TIANYi，，CHENKe．qin，ANXiu．hong，HAOHong—mei，LIUZhi，CONGPei．hua，HAOYu-jin (1CollegeofHorticultureScienceandEngineering~StateKeyLaboratoryofCropBiology,Taian271018,Shandong；2Instituteof Pomology,ChineseAcademyofAgriculturalSciences~KyeLaboratoryofFruitGermplasmResourcesUtilization,Ministryof Agriculture,Xingcheng12510~Liaoning；。LiaoningInstituteofPomology,Xiongyue115009,Liaoning) Abstract：[Objective] Cloning，sequenceandexpressionanalysisoftwoEI (ethyleneresponsivefactor)trnascription factorsfrom MalusdomestieaBorkhandexpressionoftheirfusionproteinsinE coliweredeterminedtoidentifytheirdisease resistantfunctionandmolecularmechanism．[Method]ESTsderivedrfomsuppressionsubtractivehybridizationwereblasted，and wtoEFR genes，MdAP2D4 andMdAP2D19，were cloned which contain theseESTs；Subsequently,phylogeneticrelationship includingthewtoappleprot