假海源菌ZJCN121岩藻多糖酶的制备、纯化和性质的研究.pdf

摘 要 岩藻多糖酶是一种多糖水解酶。因利用酶解法制备低分子量岩藻多糖（LMWF ）， 具有底物专一性强、催化效率高、反应条件温和、污染少、易于提取和纯化等优点， 所以已逐渐取代化学法而成为生产 LMWF 的主要方法。另外，由于该酶在研究岩藻 多糖的结构，结构与功能机制之间的关系上也有着非常重要的作用，因此，学者们对 岩藻多糖酶的研究十分感兴趣。 为了提高一株海洋细菌ZJCN121 的产酶能力，本研究通过单因素实验， Plackett-Burman设计实验和响应面实验相结合的方法对岩藻多糖酶液态发酵培养基 成分进行了优化。结果得出影响菌体产酶能力的主要因素为麸皮、氯化钠和岩藻多糖， 进而采用中心组合设计和响应面分析确定出主要因素的最佳浓度。最终获得最优培养 基组成为（g/L ）：麸皮 2.73 、氯化钠 31.04 、岩藻多糖 0.54 、葡萄糖 0.455 、硝酸钠 2 、硫酸镁 3 、氯化钙 0.04 、磷酸氢二钠 0.7 。同时用单因素实验对发酵条件进行了 优化。结果得出菌体在初始pH为6.5、接种菌龄为12h、接种量为3%，于20 ℃培养16h 时，岩藻多糖酶活力可达到1.43IU/mL，比优化前提高了2.07倍，并从该菌的产酶历 程中确定其合成岩藻多糖酶为同步合成型。 在最优条件下液态发酵培养假海源菌 ZJCN121 ，用缓冲液提取岩藻多糖酶。过 滤和离心得到粗酶液，粗酶液通过丙酮沉淀和 Sephadex G-100 层析柱纯化后，经 PAGE 电泳、SDS电泳、EIF电泳后，均显示为一条带，证明其成分单 一，达到纯化目的。其纯化倍数为 21.8 ，回收率为 13.5%，并测得该酶的相对分子量 为 60.2kDa 。等电点为4.3 。 纯酶部分性质研究结果表明：岩藻多糖酶的最适反应温度为 50℃，半失活温度 为 62℃；最适反应pH 为 6.6，稳定区间为 6.2-7.0，在此区间内的酶有较高活性。在 浓度为 1mmol/L 的金属离子存在时，Ca2+和 Ba2+对酶略有激活作用，Fe2+ 、Cu2+则强 2+ + 2+ 2+ 烈抑制酶活，Mn 、K 、Zn 也在一定程度上抑制酶活性，Mg 对酶的作用效果不 明显，其催化底物 Fucus vesiculosus 岩藻多糖的 Km 为 5.87mg/mL ，Vmax 为 6.11g/(L·min) 。 关键词：Pseudidiomarina ，岩藻多糖酶，液态发酵，分离纯化，酶学性质 I Abstract Fucoidanase was a kind of polysaccharide hydrolases, and fucoidanase could be used in preparation of low molecular weight fucoidan (LMWF) due to the advantage of enzymatic hydrolysis, such as substrate specificity, higher catalytic efficiency, mild reaction conditions and less contamination, ease of set-up and work-up. Enzymatic hydrolysis became a popular method in producing LMWF and substituted for chemical hydrolysis.In addition, fucoidanase also played an important role in