大肠杆菌不耐热肠毒素LT在烟草中表达.pdf

摘 要 labile 不耐热肠毒素(Heat 蛋白，是目前人们发现的最强有力的粘膜免疫原和粘膜免疫佐剂之一。然而，已有的研究发现， 不论是LTB的N端还是C端融合抗原，虽然能够形成正常的五聚体，且具有受体的亲合活性。但形 成五聚体的效率并与细胞表面受体结合能力以及五聚体化学稳定性，都会受到很大的影响，从 而降低了其作为抗原传输载体的效能。 动物免疫实验证实，LT全毒素分子明显l：tB亚单位五聚体有更强的免疫原性。人们研究了A、 B亚基对佐剂作用的影响。发现单独的LTB与靶抗原同时口服后，佐剂作用不明显，而微量全毒 素LT同抗原共同口服后，表现出很强的佐剂作用。 当前，对减毒LT在烟草植物叶绿体中的表达已有研究，但还未见大肠杆菌肠毒素LT在植物 胞质中表达的报道。本实验研究的目的是将从K88ac+强致病菌株中克隆的LTA、LTB基因，构建 成两种双价植物高效表达载体，其中一种是将LTA、LTB基因单独构建到两个表达框。另一种是 基因的信号肽序列体外重组；并将重组的融合基因分别定向克隆到两目的基因前。有实验证实 此融合蛋白的引入可增强外源基因在植物体内的表达。然后利用植物表达载体成功构建了带有 此融合基因不耐热肠毒素A、B亚单位基因双价植物表达载体pCUPAB。最终将重组子转化烟草， 经卡那霉素(Kan)多重筛选，获得抗性植株。对抗性植株提取DNA进行PeR分析，90％抗性植株均 呈阳性。随机选取几株生长良好的PCR检测为阳性的植株进行Westerndot检测和蛋白表达分析， 以验证六聚体和五聚体的整合效果。结果在进行Westerndot检测时只有少数样品出现杂交信 号。 本实验结果表明LT全毒素在植物胞质中能正确组装。此研究为进一步构建带有保护性抗原 类全毒素嵌合植物疫苗奠定基础。 关键词：大肠杆菌不耐热毒素LT，植物疫苗，载体构建，表达载体 Abstract Heat—labile Escherichiacoliwasan enterotoxin(LT)excreted byenterotoxigenic AB5一typed wasoneofthe andmucosal hexyl—polyprotein，whichstrongestimmunogenicity Howevertheknownresearchfoundthataminoterminalor terminalofLTBcouldform carboxyl natural andhad to the ofthe pentyl—polyproteinaffinityacceptor．Butefficiency whichwascombinedwitheellsurface and wereinfluenced it chemistrystability reduced greatly．So the astransmittedcarrierof capability antigen． The ofanimalhad that ofLTfulltoxinwas experiment immunology provedimmunity stronger than oftheB studiedinfluenceof evidently