大肠杆菌不耐热肠毒素克隆、改造及其表达.pdfVIP

摘 要 大肠杆菌不耐热肠毒素（heat-labile enterotoxin, LT ）是肠产毒性大肠杆 （Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC ）分泌的一种热不稳定肠毒素，LT 是由一个 具有毒性的A亚单位（LTA ）和形成环状的五个能够与神经节苷脂GM1结合而粘附于 真核细胞膜上的B亚单位（LTB ）组成。 能引起人和其他哺乳动物的水样腹泻。LT 除具有毒性外，还能够有效的启动局部及全身的体液和细胞免疫，具有很强的粘膜免 疫原性和粘膜佐剂活性，在粘膜免疫研究中以及粘膜免疫疫苗开发中具有重要医学价 值和经济价值。 为制备大量具有免疫活性的LT蛋白, 本实验通过提取产肠毒素大肠杆菌44815菌 株的基因组，采用PCR方法分别扩增不耐热肠毒素A亚基（LTA ）和B亚基（LTB ）的 编码基因，并将其连接在pMD18-T 载体上，构建成LTA 和LTB 基因的重组载体 pMD18-T-LTA和pMD18-T-LTB 。阳性克隆筛选采用蓝白斑选择和限制性内切酶Xho Ⅰ和Nco Ⅰ消化，最后进行序列测定。然后采用定点突变方法将LTA 的第63位的丝氨 酸改变为赖氨酸，构建成pMD18-T-LTAK63 突变体。再分别将pMD18-T-LTAK63和 pMD18-T-LTB通过 Xho Ⅰ和Nco Ⅰ位点插入到pET-20b(+)原核表达载体，分别构建成 LTA和LTB 的原核表达载体pET-20b-LTAK63和pET-20b-LTB 。将重组LTA和LTB表达 载体分别转化宿主菌Bl21 ，制备工程菌进行表达。表达产物采用SDS方法检测， 目的蛋白分离纯化采用镍琼脂糖胶粒吸附法。为鉴定带有人CD5信号肽的LTAK63基 因能否在真核细胞中表达，以pMD18-T-LTAK63为模板，通过PCR扩增LTAK63基因， 将LTAK63 基因连接在pcDNACD5sp 真核表达载体上，构建成LTAK63 重组质粒 pcDNACD5sp-LTAK63 。利用磷酸钙方法将pcDNACD5sp-LTAK63转染人胚胎肾细胞 HEK 293T细胞使其瞬时表达。 本研究构建的重组质粒pMD18-T-LTA和pMD18-T-LTB 的测序结果表明：所克隆 的LTA基因与GenBank 中大肠杆菌标准产毒株LTA基因的大小完全一致, 有4个碱基发 生了改变，同源性为99% 。在这4个突变中有3个是无义突变，不造成氨基酸的改变， 但有1个碱基的突变使谷氨酸变为赖氨酸。可见LTA基因存在着多态性；所克隆的LTB 基因与GenBank 中大肠杆菌标准产毒株LTB基因的完全一致, 同源性为100%。利用定 点突变方法构建的pMD18-T-LTAK63 突变体的测序结果表明LTA 的第63位的丝氨酸 成功的改变为赖氨酸。构建的原核表达载体经Xho Ⅰ和Nco Ⅰ双酶切，得到了符合预 期大小的特异性片段，结果证明pET-20b-LTAK63和pET-20b-LTB原核表达载体构建 成功。SDS检测宿主菌Bl21表达目的蛋白的结果显示：在细胞周质中有目的蛋 白表达，分别在分子量约为28Kda （LTA ） 及14Kda （LTB ）处有一条明显的带。而 在细胞的培养基及包涵体中未见目的蛋白表达。同时通过镍吸附法纯化得到了单一目 的蛋白。结果表明LTAK63和LTB在Pel信号肽的引导下进行了表达并分泌到细胞周 质，而不是以包涵体形式存在，因此表达目的蛋白具有一定的活性，且易于分离纯化。 在LTAK63基因进行真核表达的基础上构建的pcDNACD5sp-LTAK63真核表达载体转 染HEK293T细胞，Western blot检测结果显示在分子量约为34.8KDa处有一条明显的杂 交带，而空载体在相应位置未见杂交带。结果证明pcDNACD5sp-LTAK63真核表达载 体构建成功，并实现了它在真核细胞中的分泌性表达。 关键词：大肠杆菌；不耐热肠毒素；基因克隆；定点突变；表达 Cloning, modification and expression of heat-labile enterotoxin gene from E.coli Author: Han Dong-Mei