糖多孢红霉菌TetR家族调控基因SACE-3986功能及研究.pdfVIP

摘要 摘要 糖多孢红霉菌∞cc办甜印。拍pD，口e砂砌，．伽回是一类能产生多种复杂次级代谢 产物的营土栖生活的革兰氏阳性放线菌，红霉素就是其中一类具有广谱抑菌活性 的大环内酯类的次级代谢产物。自临床应用以来，红霉素类药物就是我国广泛使 用的主要抗菌消炎药物之一。近些年来人们在许多其他链霉菌中发现了很多参与 抗生素合成的TetR家族调控基因(阳DJ7J2，删明5，等)，暗示着在糖多孢红 霉菌TetR家族中可能存在参与调控红霉素生物合成的基因。 3她6 本研究利用片段同源重组技术灭活删CE3她6基因构建得到△尉CE 突变株。先PCR分别得到刚CE3粥6基因两侧约1500 bp的上下游同源臂，然 后将其插入到质粒pUCTSR中硫链丝菌肽抗性基因时两边的相应位置，构建出 3粥6基因替 质粒pUCTSR△3986；再利用片段同源重组技术用船基因将黝CE 39跖。△尉CE3粥6与出发菌株A226在30oC条件下进行摇瓶 换构建出△副CE 发酵，通过对不同发酵液的枯草芽孢杆菌抑菌分析初步探讨其红霉素产量的变 化，发现相比于A226，△鲥CE3粥6突变株的红霉素产量显著提高，初步的抑 菌分析显示黝CE39跖基因可能是参与红霉素生物合成的负向调控基因。 39笳 为了进一步确定剿CE39跖基因对红霉素生物合成的影响，对删CE 突变株进行了基因回复与过表达实验，将连接有脚CE39笳基因片段的整合质 粒pIBl39分别导入到删CE39跖突变株和A226中，pIBl39空载体作为对照， 得到回复菌株删CE 398卯IBl393986和对照幽CE3986和IBl39以及过表达 △黝CE 跗CE 3她6是参与红霉素生物合成的负调控基因。 为了研究脚CE3粥6基因的缺失是否会影响菌株形态分化和菌体密度，对 △跗CIE 3粥6突变株和A226的形态分化和生物量变化进行了观察和分析。结果 显示，相比A226该突变株的孢子形成无明显变化；表明剐CE3粥6基因不参与 调控孢子形成。而A226与该突变株的菌体长势基本同步，生物量变化无显著差 异；表明蝴CE39跖突变株红霉素产量的提高并非由于自身菌体密度的改变所 糖多孢红霉菌TetR家族调控基因SACE3986的功能研究 致。 3986，HPLC检测结果说明在WB中 进一步在工业菌株WB中缺失SACE 3986 缺失SACE3986红霉素产量提高37．6％-40．3％。说明在工业菌株中SACE 同样能够调控其红霉素产量。 为了探讨SACE3986基因与其上游临近基因SACE3985以及红霉素合成基 3986突变株和A226 因簇上eryAI和ermE以及之间的关系，从转录水平对ASACE 3985 进行了荧光定量分析；分析显示，相比A226，ASACE3986中eryAI和SACE 基因的转录量分别提高3．7倍和5．7倍，ermE基因的转录量提高1．7倍，说明突 变株中红霉素产量提高可能是由于上述三个基因的转录量增加所致。 3986基因调 对His6．SACE3986蛋白进行了体外表达纯化来深入研究SACE 控红霉素生物合成的机制，将