稳定表达人GM-CSF、IL-4EA.hy926细胞株建立.pdf

稳定表达人GM．CSF、ILl4的EA．hy926细胞株建立 摘 要 树突状细胞(Dendriticcell，DC)是目前所知的功能最强、并且唯一能激活初 始性T细胞fNT cell，APc)，能摄取 cell)的专职抗原提呈细胞(Antigen-presenting 各类抗原，体内、外均能激发T细胞增殖，诱导特异性细胞杀伤性T淋巴细胞(eyt otoxicTlymphocytes，CTL)生成，产生抗肿瘤效应，在免疫应答中处于中心地 位。DC独特的免疫调节作用使之成为免疫学研究的热点，并在细胞治疗领域具 有广阔的应用前景。I瞄床和研究中使用的DC通常为人外周血单核细胞(pmpheral bloodmonouelear cell，PBMC)在多种细胞因子作用下体外诱导一周得到。目前 已有多个实验室正致力于发展一种体外培养系统，在体外模拟体内微环境来诱导 单核细胞向DC分化，以重建体内单核细胞向DC分化时细胞间相互作用和信号通 路，并且取得了很好的结果。 本论文成功构建了两种包含GM-CSF和IL4的慢病毒表达质粒；包装获得 的重组慢病毒可以高效的感染内皮细胞系EA．hy926细胞，感染后的重组细胞经 RT-PCR、Westernblot及ELISA等多种方法进行蛋白翻译表达的鉴定，经鉴定感 染后细胞分别可以高效表达细胞因子GM．CSF和IL4，感染后细胞的生长状态均 良好，能够在体外进行长期传代培养，可以用于DC诱导实验；丝裂霉素C(MMC) 可以抑制细胞增殖，但不改变细胞分泌蛋白的性质，是体外常用的制备饲养层的 方法之一，我们通过试验最终确定了MMC的作用时间和浓度，以便以后将重组 的EA．hy926细胞制备成饲养层细胞来促使人外周血单核细胞分化成为DCs。 本论文共分两部分，具体如下： 一、建立两种分别表达GM．CSF和IL-4基因的重组EA．hy926内皮细胞系 利用PCR方法扩增出目的GM—CSF基因和IL4基因。将目的基因分别构建 入慢病毒表达载体pBPLV，得到两种重组的慢病毒表达载体。该两种重组慢病 毒分别经双酶切和测序鉴定显示重组质粒构建成功。重组慢病毒载体和慢病毒包 装质粒、包膜质粒共转染293T细胞，转染24h后经荧光显微镜观察转染效率达 到90％以上；收集细胞培养上清然后高速离心浓缩病毒原液，浓缩后的病毒可以 有效的感染内皮细胞系EA．hy926细胞，感染后的细胞经过扩大培养后感染效率 依然可达到90％以上，说明目的基因可以在感染细胞内稳定的传代，重组 EA．hy926内皮细胞系构建成功。 二、重组EA．hy926内皮细胞系细胞性质的确定 对感染后细胞进行生长曲线的测定，结果显示感染后细胞的生长趋势没有受 1 ㈣渊 到影响，能够很好的进行增殖；经RT-PCR反应在mRNA水平上能检测到目的 基因的表达；ELISA方法表明感染后细胞IL-4、GM．CSF在蛋白水平的表达分别 blot方法检测到重组细胞培养上清中有 是未感染细胞的80倍和143倍；Western 实验中，确定了在处理时间为2．5h时，MMC的浓度选择为lO“g／ml。在此浓度 作用下，内皮细胞系生长受到抑制，但是保持其分泌的功能。 硕士研究生杨晓琮(生物化学与分子生物学) 指导教师葛银林教授 关键词：树突状细胞；基因重组；白细胞介素4；粒细胞一巨噬细胞 集落刺激因子 Abstract Dendritic themost cellswithau cells(DCs)arepotent antigen-presentin