NDA保护性单抗的鉴定及抗原表位分析.pdf

摘要 新城疫病毒（Newcastle Disease Virus，NDV）的HN和F蛋白可以刺激机体产生 中和抗体，是NDV的主要保护性抗原。NDV是于副粘病毒科的一个成员。新城疫是由 新城疫病毒引起的对禽类危害最大的一种急性传染病,被国际兽医局列为对畜禽危害 最大的A类传染病之一。90 年代后期，报道鸡群具有高抗体水平情况下也会发生新 城疫。一些学者认为，新的基因型和亚型的出现是导致免疫鸡群出现新城疫的主要原 因。因此，新城疫疫苗的研究成为重点。本研究旨从实验室保存的单克隆抗体中筛选 得到具有保护性单克隆抗体，并进一步分析保护性单克隆抗体的抗原表位，为新城疫 疾病机理的研究和表位疫苗的研究奠定理论基础。 ELISA F48E9 F306 L27 首先，应用间接 方法检测了 株新城疫病毒分别与 株、 株 和H55 株单克隆抗体的反应效价。应用方阵法将NDV从1.5 μg/ml 稀释至0.04 μg/ml， 将NDV多抗从1:500 稀释至1:16000，确定了NDV抗原最佳包被浓度为0.37 μg/ml 和 4 F306 L27 H55 1:1000 ℃过夜的条件。 株、 株和 株单克隆抗体小鼠腹水均以 开始倍 比稀释，进行反应，测其OD492 的值。结果F306 株单克隆抗体为阴性，不与病毒反 应；而L27 株和H55 株单克隆抗体与病毒反应，效价分别为1:16000 和1:32000。根 F306 L27 IgG1 H55 IgG2b 据亚类鉴定试剂盒测得 株单抗和 株单抗均为 亚类， 株单抗为 亚类。应用饱和硫酸铵沉淀法提纯上述单克隆抗体。 其次，应用细胞微量中和试验鉴定L27 和H55 两株单克隆抗体的中和病毒能力。 方法是接种NDV 于BHK-21，计算病毒液的TCID50 (细胞半数致死量)。先将病毒稀 释至工作滴度，再与倍比稀释的单抗腹水反应，最后加入单层BHK-21 细胞，并观察 细胞病变情况并记录。根据细胞病变效应（CPE）按Reed-Muench 方法计算细胞半数 保护量（The dose of antiserum protects 50% of cell challenged,PD50）。结果只有H55 株 单克隆抗体具有一定的中和病毒能力，相对于病毒对照组，细胞病变延迟13 小时， PD50 为10-3.5；而L27 株单克隆抗体没有保护性。 最后，分析F306 株和H55 株单克隆抗体针对的抗原表位。一是应用Western blot 检测，表明这两株单抗均不与病毒反应呈现条带，提示这两株单抗针对的表位可能为 构象型表位。二是应用噬菌体展示12肽库分别筛选H55 株和F306 株单克隆抗体识 别的抗原表位。经过三轮淘选得到的噬菌体克隆，测序并利用blast 同源性分析,得到 序列IQPRMINS(M)PRP 为H55 株单克隆抗体识别抗原表位的重要序列。 综上所述，本文作者从实验室保存的新城疫病毒单克隆抗体中筛选得到一株具有 中和作用的单克隆抗体，并利用噬菌体展示12肽库筛选其抗原表位，得到相应的模 拟表位重要序列,为新城疫疾病机理研究和疫苗研究提供理论基础。 8 关键词: 新城疫病毒 抗原表位 中和单克隆抗体 噬菌体展示十二肽库 Abstract The hemagglutinin-neuraminidase (HN) protein and the fusion (F) protein of Newcastle disease virus (NDV) are the principal targets of neutralizing and