奶牛β-酪蛋白启动子结构改造和功能分析.pdf

奶牛B．酪蛋白启动子的结构改造和功能分析 中文摘要 【目的】 乳腺生物反应器具有巨大的市场前景，目前制约其产业化发展的主要原因之 一就是对乳腺特异基因表达调控机制认识不足和缺乏可在乳腺中高效、特异表达 的载体。本研究以p．酪蛋白3’一端调控区序列替换掉荧光素酶报告基因表达载体 late pGL3．Basic的SV40poly A 序列而构建出新的重组载体pGL3-F；采用重叠 PCR技术将SV40增强子序列分别插入研究小组之前构建的7种重组p．酪蛋白启 动子 耻1、叩-2、耻3、印-4、印一5、叩·6S和op—O 中，从而构建出7种新的重 组B．酪蛋白启动子，并对它们在2种不同重组载体中引导荧光素酶报告基因表达 的活性进行检测和对照分析，目的是要系统地观察： 1 p．酪蛋白3’．端调控序列对重组载体中重组p．酪蛋白启动子引导荧光素 酶报告基因表达活性的影响，探讨用p．酪蛋白3’．端调控序列替换载体中的SV40 late poly A 序列后，与重组p．酪蛋白启动子配对构建奶牛乳腺定位表达载体的 可能性； 2 在重组p．酪蛋白启动子中插入SV40增强子序列对p．酪蛋白启动子引 7导荧光素酶报告基因表达活性的影响，探讨通过在重组p．酪蛋白启动子插入外来 ‘ 增强子序列以提高p．酪蛋白启动子引导基因表达活性的途径； 3 通过对重组载体中的重组B．酪蛋白启动子的活性进行检测和对照分 析，筛选出活性最强的重组p．酪蛋白启动子，用以进一步构建奶牛乳腺高效定位 表达载体，为开展奶牛乳腺生物反应器的研究奠定基础； 4 通过在细胞培养液中加入催乳素或皮质激素的方法，观察催乳素和皮 质激素对重组B．酪蛋白启动子引导荧光素酶报告基因表达活性的影响。 【方法】 PCR扩增获取奶牛p．酪蛋白3’一端调控序列，并将其替换掉荧光素酶报告基 late 因载体pGL3-B勰ic的SV40poly A 序列，获得重组载体pGL3一F。 设计1对PCR引物，扩增出研究组之前经初步改造得到的7种重组B．酪蛋 白启动子驴l、rp-2、印．3、rp4、驴5、叫和opO。分别克隆至含B-酪蛋白3’一 端调控序列的重组载体pGL3．F上，获得7种含不同重组B．酪蛋白启动子的重组 载。 kb 5’．端片段、 设计3对重叠PCR引物，分别扩增出7对B．酪蛋白启动子2 1 kb3’．端片段和S、，40增强子序列，以重叠PCR技术分别将上述7对片段拼接 到SV40增强子序列的两端，构建出7种中间含SV40增强子序列的重组D．酪蛋 白启动子印一1S、印一2S、印·3S、印-4S、印一5S、rp．6S和0p-0S。 将这7种重组p一酪蛋白启动子 叩-lS、印一2S、印一3S、印-4S、印一5S、印一6S和 酪蛋白启动子的重组载体。 和op一0S 分别克隆至含p-酪蛋白3’-端调控区序列的重组荧光素酶报告基因载体 pGL3．F上，获得7种含不同重组p．酪蛋白启动子的重组载体。 采用脂质体技术分别将这些重组载体转染至乳腺癌细胞MCF．7，通过双荧 光素酶检测系统检测这些重组表达载体中的不同重组p．酪蛋白启动子在乳腺癌 细胞MCF．7中引导荧光素酶报告基因表达的效能，并通过在细胞培养液中加入 催乳素或皮质醇激素的方法，观察催乳素和皮质醇激素对重组D．酪蛋白启动子引 导荧光素酶报告基因表达活性的影响。 【结果】 PCR扩增、酶切产物电泳和测序鉴定结果表明： 1 通过PCR扩增获取奶牛B．酪蛋白基因3’．端调控序列，并成功用它替 late 换掉了荧光素酶报告基因载体pGL3-BaSic的SV40 poly A 序列，获得重组 载体pGL3．F。 2 采用PCR技术成功克隆出研究组之前经初步改造得到的7种重组争 酪蛋白启动子，并成功将它们分别克隆至pGL3．F载体中，获得7种含荧光素酶 报告基因、p．酪蛋白3’．端调控区和不同结构的重组B．酪蛋白启动子的重组载体。 3 采用重叠PCR拼接技术成功构建出了内含SV40增强子序，且分别剔 除掉5’．端调控区内所含的负调控序列、负调控序列和转座子序列重叠区、转座 子序列等片段，从而得到具有不同序列结构的7种重组p．酪蛋白启动子印．1S、 rp一2S、印一3S、印_4S、巾一5S、rp6S和opOS。 2 4 成功将7种内含SV40增强子序列的重组p．酪蛋白启动子分别克隆至 荧光素酶报告基因载体pGL3．BaSic中，获得7种含荧光素酶报告基因和不同结 构的重组p一酪蛋白启动子的重组载体。 5 成功将内含SV40增强子序列的重组B．酪蛋白启动子分别克隆至含有B． 酪蛋白3’．端调控区序列的pGL3．F载体中，获得7种含荧光素酶报告基因、p． 酪蛋白3’一端调控区和不同结构的重组p．酪蛋白启动子的重组载体。 6