紫杉二烯合成酶及其肿瘤血管生成抑制因子基因克隆和转基因的研究.pdf

摘要 恶性肿瘤是严重威胁人类健康的第二大杀手，寻找对肿瘤细胞具有高杀伤力 而对正常细胞毒副作用小的新型抗肿瘤药物，具有非常重要的现实意义。本研究 的目的旨在利用赤霉菌中存在的二萜类化合物赤霉素的代谢途径构建能够表达 生产紫杉醇前体的重组赤霉菌，为20世纪人类发现的最重要的新型抗癌药物二 萜类化合物紫杉醇开辟新的药源途径，为缓解药源短缺对紫杉醇应用范围进一步 扩大造成的严重限制提供理论和技术依据；另～方面，为新一代抗肿瘤活性分子 肿瘤血管生成抑制因子—～n弓sten寻找安全、有效、廉价、易于推广应用的蛋白表 达生产系统。 I采用R■PcR方法从红豆杉胚性愈伤组织细胞系E3B中克隆紫杉二烯合 成酶基因全长cDNA。将可以在大肠杆菌BL21s中表达、序列正确的紫杉二烯合 选择标记潮霉素B抗性表达框引入pAN52．1Not完整转录单位的侧翼区域，获得 紫杉二烯合成酶基因cDNA表达载体pm讯s—hyg。 1I采用PcR扩增法从赤霉菌基因组中克隆了赤霉素生物合成途径中第一 个特异性关键酶——内根一贝壳杉烯合成酶基因哪的部分序列作为同源片断， 以平端连接的方式引入丝状真菌表达载体pcsN44的HindlⅡ位点，获得旨在中 断赤霉素生物合成途径的印s基因打靶载体pCSNcps。 III通过单因素实验建立了本实验用赤霉菌菌株原生质体制各方法。研究结 果表明，以10ml含15％粗制崩溃酶的酶解体系于37℃酶解4h，6个实验用赤霉 菌受试菌株的原生质体产量都可以达到106／IIlL，能够满足遗传转化操作的需要， 而使用溶壁酶制备实验用赤霉菌菌株原生质体的产量不足103／mL。 Ⅳ建立了适用于赤霉菌菌株cBSl95．34的原生质体伊EG法转化体系，通过 原生质体伊EG转化法获得少量赤霉菌转化子。经过PCR检测及Soutllemblot杂 交检测，证实本研究采用原生质体伊EG法以pANts—hyg转化获得一株基因组整 合有紫杉二烯合成酶基因cDNA的赤霉菌转化子和4株pCSNcps转化、潮霉素 B抗性水平高于亲本菌株的赤霉菌转化子。整合有外源基因的赤霉菌转化子的生 长形态和生长能力与亲本菌株相比存在显著差异。而且，随着传代次数的增加， 生长能力明显下降；用∞i基因打靶载体pcsNcps转化赤霉菌的研究结果表明， 简单的插入型打靶载体，即使携带足够长的同源序列，也不利于通过同源重组方 式破坏靶基因E眇而致使赤霉素合成中断的赤霉菌转化子的获得。 V考查了电击转化和基因枪转化法对于实现赤霉菌遗传转化的有效性。研 究结果初步表明，不同的赤霉菌菌株，其转化性能差异很大；电击转化法对提高 赤霉菌原生质体转化效率没有明显效果；采用基因枪法转化赤霉菌菌丝断片也未 获得比原生质体伊EG法更好的结果。 Ⅵ采用一步法RT-PCR从人胎盘组织中扩增出读码框架大小为690bp的肿 瘤血管生成抑制因子ArrestencDNA。经亚克隆引入植物双元表达载 I和BscE pa址也IAl30l的Nc0II位点之间，获得目的基因植物表达载体 带目的基因的重组根癌农杆菌LBA4404(pC舢忸Ina叫。 Ⅶ采用叶盘法以重组根癌农杆菌LBA4404(pCAMB认a砷转化烟草秦烟95， 经过潮霉素B筛选、PcR及southenblot杂交检测，获得2个转基因烟草再生株， 进一步的RT-PcR检测结果表明，目的基因在转基因烟草中存在转录水平上的表 达。该结果同时也验证了选择标记的有效性和表达载体在宿主植物中的可用性， 为进一步目的产物分离、生物活性及其他转基因作物的获得奠定了较好的实验基 础。 关键词：紫杉二烯合成酶，赤霉菌，原生质体转化，肿瘤血管生成抑制因子，烟 草，基因转化 II Abstract tllat Canceristhesecondsenousdise船e threatenshum锄heanh．Ithas immcdiate to new anticancerwith devcloptype dmgs si驴ific锄ce h