总RNA提取定量与RTPCR.ppt

操作步骤 采用TaKaRa PrimeScript RT reagent kit进行cDNA第一链合成： 按下列组分配制RT反应液 5X PrimeScrip Buffer 2.0μl PrimeScript RT Enzyme Mix 0.5 μl Oligo dT Primer (50 μ M) 0.5 μl Random 6mers (100 μ M) 0.5 μl Total RNA 6.5 μl 总体积 10?l 反转录反应条件如下 37℃ 15min （反转录反应） 85℃ 5sec （反转录酶失活反应） 注：反转录步骤在PCR仪中进行 第一链cDNA 2?l PerfectShot Taq 10?l 上游引物 (10?M) 1?l 下游引物 (10?M) 1?l RNase Free H2O 总体积 6?l 20?l 取0.2 ml PCR反应管一只，用微量加样枪按下述顺序分别加入各试剂(注意每换一种试剂换一个新吸头)： 如配好的反应液较多沾到管壁上，可将PCR反应管置台式离心机中瞬时离心，使反应液集中于管底，然后将反应管放到基因扩增仪(PCR仪)上 . PCR反应体系 ① 94℃预变性5分钟后开始以下循环 ② 94℃ 30 秒 55℃ 30 秒 30 循环 72℃ 30 秒 ③ 72℃ 5 分钟 ④ 4 ℃ 保温 实验过程约1小时30分钟 PCR参数设置 PCR 反应的每一个温度循环周期都是由DNA变性、引物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反应参数是94℃变性30s， 60℃退火30s， 72 ℃延伸45s。如此周而复始，重复进行，直至扩增产物的数量满足实验需求为止。 温度（℃） 时间（min） 94 72 60 94℃变性（30s） 55 ℃退火（30s） 72 ℃延伸（30s） 循环1 循环2 循环3 PCR反应的温度循环周期 本实验所扩增的产物DNA片段长度400bp～500bp, 可取5?l PCR产物以1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。利用标准DNA marker评估扩增的特异性。 琼脂糖凝胶电泳 /sfzx/ 总RNA的提取、定量与RT-PCR 南方医科大学 生物化学与分子生物学实验教学示范中心 Expertimental Teaching Center of Biochemistry and Molecular Biology 完整RNA的提取和纯化,是进行RNA 方面的研究工作如Nothern杂交、mRNA分离、RT-PCR、定量PCR、cDNA合成及体外翻译等的前提。 掌握从细胞中提取总RNA的方法 熟悉紫外吸收法检测RNA浓度与纯度的原理及测定方法 掌握RT-PCR基因扩增的原理和过程 目 的 实验流程 提取原理 操作步骤 逆转录原理 操作步骤 提 取 总RNA 定 量 合成cDNA 第一链 原理体系 引物选择 PCR 电泳原理 电泳步骤 电 泳 计算方法 操作步骤 第一部分 细胞总RNA的提取及定量Extraction and Quantitation of Cell Total RNA  所有RNA的提取过程中都有五个关键点： 样品细胞或组织的有效破碎； 有效地使核蛋白复合体变性； 对内源RNA酶的有效抑制； 有效地将RNA从DNA和蛋白混合物中分离； 对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。 关 键 点 原 理 10-5μg RNA/细胞 RNA分离的方法：异硫氰酸胍氯化铯超速离心法；盐酸胍-有机溶剂法；氯化锂-尿素法；蛋白酶K-细胞质RNA提取法；异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法(Trizol法)等。 目前常用的是Trizol法。 rRNA 80-85%：28S 18S 5S tRNA, snRNA 10-15% mRNA 1-5% 原 理 Trizol 是一种新型总 RNA 抽提试剂 其主要成分是异硫氰酸胍和酚。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质，其主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白/核酸物质解聚得到释放。 酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制RNA酶活性，因此Trizol中还加入了8-羟基喹啉、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase