《Kras突变基因真核表达载体的构建及在不同肝细胞株中的表达.》.pdf

现代生物医学进展 www．shengwuyixue．com ProgressinModernBiome~cmeVolA4 NO．1 JAN．2014 DOI：10．13241j／．cnki．pmb．2014．01．004 Kras突变基因真核表达载体的构建及在不同肝细胞株中 的表达 术 张晶晶 陆小军 叶奕菁 郭 翔 (1中山大学附属中山医院肿瘤放疗科 广东 中山528403；2中山大学肿瘤防治中心鼻咽科 广东广州510060) 摘要 目的：构建携带突变Kras基因，以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为报告基因的重组真核表达栽体，并导入两种不同的肝细胞 株中表达。方法：PCR扩增突变Kras目的基因，将该全长基因定向克隆至真核表达载体pEGFP-N1上，构建重组质粒载体。并利用 脂质体转染人肝癌细胞株Huh7．5和鸡肝癌细胞株LMH，在活细胞状态下用荧光显微镜直接观察Kras．EGFP融合蛋白在细胞中 的表达；用WesternBlotting方法验证Kras蛋白水平的表达。结果：酶切和测序证实pEGFP—NI．Kras重组质粒构建正确，将EGFP 报告基因融合在突变的Kras基因的3’端；在Huh7．5和LMH中均观察到了绿色荧光 ，转染率分别为 19％和53％；WesternBlott— ing也检测到融合蛋白的表达。结论：通过基因克隆方法成功构建了pEGFP—Nl—Kras重组质粒载体 ，并且在Huh7．5和LMH中均 稳定表达 ，为下一步筛选针对突变Kras基因的靶向药物奠定了基础。 关键词：Kras；突变；绿色荧光蛋白；基因转染 中图分类号：Q75，Q78。R730．231 文献标识码：A 文章编号：1673—6273(2014)01．18．05 ConstructionofpEGFP．N1． asExpressionVector andItsExpressioninDifferentLiverCellLines* ZHANGJing-jing ，LUXiao-jun YEYi-jing+,GUOXianf (1DepartmentofCarcinomaRadiotherapy,AffiliatedZhongshanH0spitalofSunYat-SenUniversiyt,Zhongshan,Guangdong, 528403,China； 2DepartmentofNasopharyngealCarcinoma,CancerCenter,SunYat-SenUniversity,Gunagzhou,Guangdong,510060,China1 ABSTRACTObjective：ToconstructpEGFP-N1eukaryoticexpressionvectorbyusingenhancedgreenfluorescenceproteinas reportergeneandtransfectingtwodifferentlivercelllines．Methods：ThemutatedKrasgenewasamplifiedbyPCR techniqueand insertedintopEGFP—N1vector．Thehumanhepatomacellline(Huh7．5)andchickenhepatomacellline(LMH)wastransfectedwiththe recombinantplasmidbymeansoflipidosome．TheKras—EGFPfusedproteinwasvieweddirectlywithfluorenscemicroscope，andthe expressionofKraswasdetectedbyWestem Blotting．Results：Therecombinantplasmidwasformedcorrectlybytheanalysesofenzyme restrictionandDNA sequencing．andthe3’endofmutatdKrasgenewasufsedwithEGFP