羊附红细胞体生物学特性及研究与PCR和ELISA检测方法建立.pdf

摘要 为了研究附红细胞体在体外生长变化的规律，为附红细胞体的体外培养提供依 据，在羊附红细胞体感染的血液中分别加入三种抗凝剂，试找出对羊附红细胞体 ovis)体外生长影响最大的一种抗凝剂。结果表明，柠檬酸钠溶液能 (Eperythrozoon 使附红细胞体在体外血液中维持一定的数量。在柠檬酸钠溶液中加入葡萄糖和 NaHC03，研究了营养成分的添加对羊附红细胞体的影响。结果表明，在抗凝剂中添 加葡萄糖和NaHC03能显著地提高附红细胞体的数量。故在其后的试验中，采用添加 增殖活性的特性，血样必须在采后12h内处理。 对附红细胞体的流行病学调查表明，附红细胞体对羊的感染率有一定的季节性，与吸 血昆虫有一定的关系。寒冷季节，附红细胞体的感染率非常低，温暖潮湿的春夏季节， 感染率呈上升趋势，在炎热的季节，附红细胞体的感染率非常高，常常达到80％以上。 对附红细胞体进行分子水平上的研究始见于20世纪80年代，随着基因工程技术 的迅猛发展，对该病的研究也逐渐深入到分子水平上。本试验根据羊附红细胞体的 16S 得到两条500bp以上的条带，与预期结果一致，说明PCR方法扩增出了羊附红细胞 体的特异条带。并经交叉性和灵敏性试验证明，该方法特异、灵敏、快速，可从分子 水平上对附红细胞体病进行早期快速诊断和流行病学调查，是一种理想的精确检测该 病的方法，能及时掌握该病的流行情况并迅速准确地对可疑病例作出诊断，杜绝该病 的大规模爆发，对控制该瘸的大范围流行具有重要意义。 附红细胞体病的诊断一直以来都是以镜检法作为标准，然而由于附红细胞体个体 很小，镜检法有一定缺陷，并且缺乏特异性，故寻求一种快速、特异的诊断方法就成 了当务之急。本试验利用血清学技术，摸索了酶联免疫吸附试验(ELISA)的最佳工 作条件。自行采集血液，提纯抗原，用常规方法免疫家兔，制备阳性血清，进行酶联 免疫吸附试验，并与镜检法作比较，证明ELISA作为诊断羊附红细胞体病的一种方 法具有特异、灵敏、快速、高效的优点。以辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔抗体 为酶标二抗，最佳工作条件为抗原稀释度64倍、阳性血清稀释度160倍、酶标二抗 稀释度1000倍，一抗和二抗的最佳反应时间为lh。对羊附红细胞体的最小检出量为 ix 50．30 g／ml。与支原体、大肠杆菌、葡萄球菌无交叉反应，证明该方法具有良好的 特异性。ELISA方法适合于大规模养殖场对附红细胞体病的调查，从整体水平上把握 该病的流行情况，为控制该病的传播提供依据。 关键词：羊附红细胞体；流行病学；ELISA：PER Characteristicsof ovisandDetecfion Biological Eperythrozoon of the chainreactionandELISA usingpolymerase MedicmePost Speciality：PreventiveVeterinary graduated：YangPeng-hua Researchdirection：Animal Jian-hua parasitologyTutor：pmfQIN Abstract Threekindsof were inthe used bloodinfected anticoagulant byEperythrozoon resultindicatedthatCitrateaffectedit’S ovis．The mostinvitro．And multiplication ov