螺旋藻%2f节旋藻原生质球制备和RAPD分析及研究.pdfVIP

螺旋藻／节旋藻原生质球制备和RAPD分析研究 摘要 原生质体(球)是生理研究和遗传育种的良好材料，原生质球的制各在节旋藻 基因工程中也是不可缺少的实验手段。本论文论述了钝顶节旋藻FACHB341原 生质球的制备方法，对已有的制备钝顶节旋藻原生质球的方法进行了改进。文中 探索了节旋藻原生质球制备的最佳去鞘方法、缓冲液最佳pH值、最佳渗透稳定 剂、最佳的酶组合以及溶菌酶的最佳浓度和酶解时间。实验结果证明，制备钝顶 节旋藻原生质球需要将超声波法、离子法和酶解法相结合，其有利组合如下：取 中进行超声波处理，能量为：3～5W，超声处理1．Os，间歇0．5s，处理2rain。 浴低速震荡下酶解5～7小时，低渗爆破法检测原生质球，显微镜下计数细胞总 数，经伊文思兰染色液活体染色每隔1．5小时计数原生质球数目，得出活体原生 质球得率。此方法可以得到40％以上有活性的钝顶节旋藻原生质球，为节旋藻的 进一步遗传转化以及基因工程研究提供了实验基础。 同时本研究对本实验室保存的9株螺旋藻和节旋藻品系：钝顶节旋藻 DNA(RAPD)研究。为得到一个稳定的RAPD反应体系，首先对影响反应体系 稳定性的主要因子进行了优化，优化结果为：在259L反应体系中DNA模板用 dNTPlp 量50rig，M92+浓度2．5mmol／L，引物浓度为29m01]L，10ram L，Taq聚 获得各样品间的相似性，再用D=I—S获得相应的遗传距离，应用Phylip软件包 分析，按UPGMA法构建聚类分析图。其结果如下： (1)对60个随机引物进行筛选，其中有15个引物重复性好，条带清晰， 多态性高。15个引物在9个品系总计扩增出140条条带，平均每个引物扩增出 9．3条，其中多态性条带为139条，占99％以上。 (2)通过品系间遗传距离发现，各品系间遗传距离最远的是FACHB351和 9株藻的遗传距离从总体上看都相距较近，说明它们的遗传背景较为相似，这也 与它们的分类地位较一致。 (3)从聚类图上看出，9株品系首先聚为三类，其中FACHB351为第1类， FACHB341为第1I类，其他7株聚为一类属第1II类：第1Ⅱ类又分为两支， 支。 上述分类结果与9个品系的某些生理生化和分子生物学特性相吻合，但与依 据藻丝体显微形态特征的经典分类有出入，因此，尽快在分子水平上建立合理、 有效的螺旋藻，节旋藻分类及新品种(系)鉴定方法，．具有十分重要的理论与实 际意义。 关键词螺旋藻；节旋藻；原生质球； RAPD；聚类分析 i on I asts iraandRAPD of from Preparatspherop Arthrosp of and SpirulinaArthrospira anaiysiS Abstract the materialsof research Piotoplasts(spheroplasts)areappropriate physiological and the of of geneticbreeding．Forgeneticengineering Arthrospira，thepmparation isan meanstOO．Inthis discussedthe protoplastsindispensable paper,we preparation methodsof