细胞干扰素.ppt

病毒感染后的机体反应 干扰素的作用 四 干扰素抗病毒机理 抗体工程药物的概念 将两种分泌不同特异性单抗的杂交瘤细胞进行再次融合，产生四源杂交瘤 (quadroma)。但二次杂交瘤细胞株分泌的是两套重链，轻链的随机组合物。BsAb在其中的比例可为10%～50%不等。多倍杂交瘤细胞的稳定性差，BsAb的产量少且活性低，费时费力，临床应用时存在人抗鼠抗体免疫反应 (HAMA)，因此不适用于临床。 抗体药物－研制新药的先锋 分别分离纯化两种不同的McAb，使各抗体解离为单价抗体，再使两种不同抗原特异性的单价抗体通过化学试剂交联起来，然后分离出目的组分。此法缺点是容易导致抗体失去活性，产物均一性不佳。 化学交联BsAb 细胞工程BsAb 多采用抗体分子片段,如Fab，Fv或ScFv,经基因操作修饰后,或体外组装为BsAb,或直接表达分泌型的BsAb。 基因工程BsAb 从广义讲应属于双功能抗体范畴。 （1）配基—配基型融合蛋白，如 CD4-Fcγ. （2）配基—Ig型嵌合抗体，如 IL-2-Ig （3）配基—FV型嵌合蛋白，如 CD4-FVCD3 (4) 受体—FV型融合蛋白 （5）酶—抗体型融合蛋白（abeneyme,抗体酶） 四、抗体融合蛋白 原核细胞表达： 真核细胞表达：酵母、昆虫细胞、中国仓鼠卵细胞、真菌等。 转基因植物表达：烟草叶和拟南芥植物。其产量可达叶片总蛋白量的1.3%。 转基因动物表达：单基因水平上做转基因鼠。 基因工程抗体的表达 第四节 噬菌体抗体工程 它是在PCR技术和Phage Display的基础上实现的。其过程是把用PCR法得到的抗体基因插入丝状噬菌体的DNA，与噬菌体外壳蛋白的基因相连，在辅助噬菌体的帮助下，噬菌粒包装成丝状噬菌体，抗体分子通过与P Ⅲ或PⅧ相连，在噬菌体表面的一端或分散分布，然后可直接对噬菌体表面的抗体分子进行筛选。 噬菌体抗体库技术 1990年Mc Cafferty等成功地建立了噬菌体表面展示系统，通过将抗溶菌酶单链抗体基因克隆于fd噬菌体基因3的下游，使ScFv以融合蛋白的形式展示于噬菌体表面，利用亲和层析，两轮富集达106倍。该技术的成功给抗体基因的筛选工作带来了革命性的变革。 噬菌体表面展示系统(phage surface display system ) 用PCR扩增人抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因 克隆到噬菌体载体并以融合蛋白的形式表达在其外壳表面 用抗原抗体反应筛选出表达所需要抗体的克隆并扩增。 使抗体基因以分泌的方式表达，获得可溶性的抗体片段。 抗体库： 组合抗体文库：在建库过程中如果将VH和VL随机组合 人天然抗体库：抗体mRNA来源于未经免疫的正常人 （一）基本原理和程序 噬菌体抗体库 （二）噬菌体表面展示文库技术的要点 外源基因表达多肽以融合蛋白形式展示在外壳蛋白N端 将基因组合文库插入噬菌体编码膜蛋白的基因 g3或g8 的先导系列的紧靠下游 随机克隆入相应载体形成组合文库 从免疫或未被免疫的B细胞中PCR扩增抗体全套基因片段 用固相化抗原经“亲和结合一洗脱一扩增”数个循环直接、方便、简捷、高效地筛选出表达特异性好、亲和力强的抗体噬菌体库。 使翻译出的抗体分泌到细菌的质周腔内，形成游离的抗体片段，经过纯化即可获得目的抗体。 筛选到的噬菌体再将基因g3或g8切除后，转入大肠杆菌， 7、单克隆抗体的纯化 根据Ig的类和亚类以及用途选择不同的纯化方法： 体外诊断试剂IgG类-----沉淀处理+亲和层析 IgM类------沉淀处理+凝胶过滤 体内诊断试剂或治疗用药-----亲和层析+阴离子交换层析，注意除去毒素、病毒、核酸等微量的污染物。 盐析沉淀 亲和层析 离子交换层析 McAb的纯化 8、 单克隆抗体的性质鉴定 Ig类型、亚类测定：双扩法或ELISA法 特异性测定：抗原类似物的交叉反应 效价测定：用腹水或培养液的稀释度表示? 表位测定：几株单抗是否为不同表位特异的,用竞?争抑制法，相加指数法及微机集群分析 亲和性测定：测定亲和常数K 杂交瘤细胞染色体：秋水仙素裂解法，小鼠B细胞染色体40条，SP2/0细胞68条，杂交瘤细胞一般100多条 McAb靶抗原分子量：常用western blot 单克隆抗体的特性 高度特异性 高度的均一性和可重复性 弱凝集反应和不呈现沉淀反应 对环境敏感性 A、McAb均是鼠源性抗体，应用于人体内可产生人抗鼠抗体（HAMA），加速了排斥反应，在人体内的半衰期只有5~6h，维持有效药物作用靶组织时间； B、完整的抗体分子的相对分子质量过大，难以穿透实体肿瘤组织，达不到有效的治疗浓度。 McAb 在免疫导向疗法中存在的问题（障碍）： A、降低McAb的免