第九章植物细胞代谢产物制备.ppt

植物细胞培养制备代谢产物 植物细胞培养制备代谢产物 植物中含有数量极为可观的次生代谢物质。 据保守的估计，目前已发现的植物天然代谢物已超过2万种，而且还在以每年新发现1600种的速度递增。 《本草纲目》中记载的1892种药物中绝大多数是植物。 目前，仍约25%的法定药品来自植物。 早在1956年，Routier和Nickell就提出工业化培养植物细胞以提取其天然产物的大胆设想。 细胞代谢产物分为初级代谢产物和次级代谢产物。 初级代谢产物是指微生物通过代谢活动所产生的自身生长和繁殖所必需的物质，如氨基酸、核苷酸、多糖、脂类、维生素等具生理活性物质或为生长提供能量的必不可少的物质。 次级代谢产物是指微生物生长到一定阶段才产生的化学结构十分复杂、对该生物无明显生理功能，或并非是该生物生长和繁殖所必需的物质，如抗生素、毒素、激素、色素等。 如下列物质哪些是初级代谢产物，哪些是次级代谢产物： 亮氨酸、苯丙氨酸、腺嘌呤、甘油三酯、人参皂苷、紫杉醇、青霉素、麻黄碱、肉毒素。 初级代谢产物和次级代谢产物 植物次级代谢产物 根据药用情况大致分为： 1、苷类：皂苷（人参皂苷、三七皂苷、柴胡皂苷） 2、固醇：菜油固醇、豆固醇、胆固醇 3、生物碱：吡啶类（槟榔碱）、嘌呤类(咖啡碱、茶碱) 4、酚类化合物：黄酮类；醌类（苯醌、萘醌、蒽醌） 5、萜类化合物：三萜皂甙（ dài ）；单萜；二萜（紫杉醇） 6、多炔类、有机酸 植物次生代谢产品的市场潜能 产品 抗癌 植物 价格（$/KG） 喜树碱 抗肿瘤 喜树 432000 秋水仙碱 抗肿瘤 秋水仙 35000 吗啡 镇静剂 罂粟 340000 紫杉醇 抗癌 短叶红豆杉 600000 长春新碱 抗白血病 长春花 2000000 植物细胞培养生产次级代谢产物过程 细胞株的筛选 细胞培养 次级代谢产物合成 次级代谢产物提取 提高次级代谢产物产量的途径 细胞株的筛选 细胞系(Cell line)是由原代培养经传代培养纯化，获得的以一种细胞为主的、能在体外长期生存的不均一的细胞群体。 细胞株(Cell strain)是指从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群。由原细胞株进一步分离培养出与原株性状不同的细胞群，亦可称之为亚细胞株。 适用于生产的细胞株必须满足的条件： （1）分散性好，适合大规模悬浮培养。 （2）均一性好，细胞大小、生理状态一致。 （3）生长速度快，培养周期短，不易染菌。 （4）目标产物含量高，容易分离提取。 （5）细胞遗传稳定。 适合工业生产用细胞株的一般筛选流程 1.愈伤组织的诱导与培养：选用植物的目标化合物高产部位作为外植体诱导愈伤组织。 2.单细胞分离：选取生长快速而疏松的愈伤组织，分散接种固体培养基继代培养，挑选生长快速的细胞。 3.细胞株的建立：转移到液体培养基中进行悬浮培养，从中选择分散性好、生长速度快的细胞。 4.细胞株筛选：检测目标产物含量，从（3）中选择目标产物含量高的细胞株。 5.性能评价：进行较大规模培养，考察细胞生长与目标产物合成的稳定性。 6.细胞株获得：得到适合工业化生产的细胞株，细胞株保种。 细胞株定向富集驯化 定向富集驯化是一种有效的筛选技术，包括： 1、激素自养型细胞株的驯化筛选 如：将愈伤组织或分离到的细胞接种在不含生长素、分裂素的继代培养基中进行传代培养，挑选生长好的细胞进行反复继代培养驯化，可以获得激素自养型细胞。 2、耐受高剂量有毒物质的细胞株驯化筛选 如：将愈伤组织或分离到的细胞接种在含高浓度乙酸盐、苯甲酸钠等毒性化合物的培养基中，反复继代培养驯化细胞，不断提高这些毒性化合物的浓度，可以获得耐受性高的细胞株。 细胞株人工诱变筛选 1、细胞融合 2、细胞重组 3、基因突变 三个人工诱变系统： 1、悬浮培养系统 速度快，细胞群体均匀，突变体筛选容易 2、愈伤组织系统 继代培养的同时进行选择压力筛选 3、原生质体系统 体外诱变容易 细胞培养 工业化、产业化过程---细胞培养有分批式、流加式、半连续式、连续式和贯流式5种（参考第四章内容）。 产物积累与细胞生长关系 a：生长偶联型：产物合成发生在细胞生长过程中，到达平台期后合成停止。 b：中间型：产物合成出现在细胞生长旺盛阶段，在平台期也能合成，但是速度减缓。 c：非生长偶联型：产物合成出现在细胞生长平台期。 两步培养法 1、植物细胞培养中为何经常采用两步法？ 许多植物细胞培养研究表明，促进细胞生长的条件和促进次生代谢物生产的条件并不相同，一些促进细胞生长的因子往往抑制次生代谢物的合成和积累，因此宜用两步法。 2、何为二步法？ 第一步，愈伤培养在生长培养基上使细胞快速增殖。 第二步，细胞生长通过指数生长期后，转移到生产培养基上进行第二步培养，以获得最高次生产物产量。 （