虎纹捕鸟蛛毒素组学分析和几种蜘蛛多肽毒素的结构功能关系的研究.pdf

中文摘要 huwena 虎纹捕鸟蛛(Ornithoctonus Wang)是中国南方发现的 一种具有很强毒性的蜘蛛新种。本实验室前面的研究中已经从中鉴定 到十多种具有不同生物学活性的毒素组分。本文通过蛋白质组分析方 法结合多维色谱技术对虎纹捕鸟蛛粗毒进行了一个系统的、全面的毒 素组学分析。粗毒通过分子筛被分为两个部分：分子量lOkDa以上的 蛋白质和分子量lOkDa以下的多肽组分。对分子量lOkDa以上的蛋白 质，利用2-DE分离，PDQUEST软件分析，发现了大约300个蛋白质点； 同时我们对这些组分也进行1DE分离。对所有IDE条带和2DE胶上的蛋 确鉴定到90种蛋白质，包括一些具有重要生物学意义的酶、结合蛋白 质和调控蛋白质等。通过阳离子交换和反相高效液相色谱柱层析 133种组分，并利用Edman降解技术得到了其中47种多肽序列，这些多 肽序列与其它动物毒液中的多肽序列相似性很低，并且表现出结构和 功能的多样性，这也表明了虎纹捕鸟蛛毒液的独特性。进化分析表明 这些多肽可以分为几个超家族，并且在进化过程中发生了基因复制和 定点突变。 种双功能多肽毒素，兼有丝氨酸蛋白酶抑制活性和钾离子通道阻断活 个氨基酸残基组成，分子量为6166．2Da。三维结构解析表明HWTX一Ⅺ 对二硫键。通过表面等离子共振技术测得HWTX-Ⅺ与胰蛋白酶的解离 常数为1×1012M，与胰凝乳蛋白酶的解离常数为1．56X10～M；利 用等温滴定量热法准确测定HWTX-XI与胰蛋白酶的解离常数为 8．92×10。2 M。l-MX-XI对DRG细胞上的钙通道和钠通道没有作用，但 能够抑制DRG上的外向延迟整流钾电流。电压钳实验进一步证明 HWTX一Ⅺ能够抑制表达在爪蟾卵母细胞上的Kvl．1电流，半抑制浓度为 2．57pM，对Kvl．2和Kvl．3电流也有比较弱的抑制作用，这种抑制具 据结构解析的结果在可能的活性区域设计了18个突变体，并使用载体 没有表现出胰蛋白酶抑制活性，突变体S16R、R12P和G36R的酶抑制活 性下降1~3倍，而突变体RIOT的酶抑制活性上升了大约6倍，这些结果 表明Lysl4是HWTX-XI的关键活性残基，临近的几个残基是胰蛋白酶抑 制活性的重要残基，这些残基突变不影响HWTX—xI的钾通道活性。 毒索活性下降弘10倍，这部分残基的突变不影响它们的蛋白酶抑制活 家族多肽毒素的进化提供了非常有价值的线索。 敬钊缨毛蛛(Chilobrachysjingzhao)是最近在我国海南省发 现的一种蜘蛛新种。结合阳离子交换和反相HPLC的方法，我们从其粗 毒中纯化到三种新的毒素多肽，并命名为敬钊缨毛蛛毒素一XI 为3726．38、3665．4和4122．5Da，由34、29和35个氨基酸残基组成， 6个Cys形成三对二硫键。利用双电极杆电压钳技术我们鉴定了这三种 毒素及其它三种敬钊缨毛蛛毒素(敬钊缨毛蛛毒素一I(JZTX-I)、敬 钾离子通道的影响特征。电压钳结果表明这六种毒素都以调制通道门 控特征的方式作用于Kv2和Kv4通道，但对这两种通道家族表现出不同 抑制剂， Ⅱ 道亲和力。这些毒素的结构一功能关系研究表明，毒素分子表面活性 区域的电荷分布差异导致的静电各向异性是毒素对离子通道不同选 择性的关键因素。抑制动力学结果表明，在半有效量的毒素浓度下， 它们的抑制动力学有很大的差别。JZTX-V表现出最快的抑制速度(抑 制常数为-≈9．5S)，这种抑制是可逆的，把毒素洗脱掉以后， 电流以非常快的速度恢复到对照水平(时间常数为15s)，另外五 种毒素都表现出通道毒素的慢抑制动力学特征。针对这六种毒素的不 同离子通道选择性和动力学特征，我们进行了进化方面的分析，结果 表明这六个毒素在进化树上分别属于三个不同的分支。这个结果和我 们电压钳得到的结果是一致的。这些毒素的研究为我们更好地去了解 门控调制毒素的作用机制提供了很好的工具。 综上所述，本课题从毒素组的的角度对虎纹捕鸟蛛粗毒组分进行 了一个整体的研究，并从虎纹捕鸟蛛和敬钊缨毛蛛毒液中发现并鉴定 了两类具有不同生物学活性的蜘蛛毒素，对其进行了结构与功能方面 的研究，获得了一批对探索蜘蛛肽类毒素有较重要学术价值的结果。 关键词：蜘蛛毒素，Kunitz型抑制剂