结球白菜结球期叶片表达序列标签基因表达的分析.pdf

摘 要 结球自菜(Brassica，·apa L．ssp．pekinensh；)原产于我国，是我国北方地区的 重要蔬菜之一。在长期的自然进化和人工选择的共同作用下，形成了以贮藏营养 物质为功能器官的11‘}．球。研究叶球的形成过程无疑对于提高大白菜的产量和品质 有着重要的意义。目前有关结球机理的研究在国际范围内仍然处于起步阶段。为 了从基因组水平了解结球期叶片的基因表达情况，实验室先前构建了结球白菜结 球前期包心叶和球叶eDNA文库，通过对文库的进一步处理和分析，我们获得了 以下主要结果： 噬菌体克隆向质粒克隆的转变，并完成全部转化菌的质粒提取工作。随机挑选质 粒进行序列测定，获得2802个较好的测序结果，其中1361个序列为自测，1441 个序列由上海生工及鼎国生物技术公司测定。对影响测序反应的因素进行了探 索，发现所用质粒模板的纯度和用量是影响测序成功与否的关键因素。 初步分析表明，插入片段长度小于150 bp或者全为polyA的序列共268个， 没有任何插入片段的空载体序列有162个。去除以上两类序列后，共获得2372 条可用于后续分析的有效EST序列，占全部序列的84．6％。全部片段总长度为 1088467 bp，高于同类物种EST研究报道的平均长 bp，平均每EST长度为459 度。 bp，平均长度为477 列约占EST总数的36．8％。 利用blastx程序，在蛋白质水平上与登录在NCBI非冗余蛋白质数据库(fir) 源物，r’I有效EST总数的76．3％。比划分值小于80及没有同源物的部分与 est 认为是首次报道的EST序列。 物利，来源上看，虽然功能已知的同源蛋白质中，来自拟南芥的占有绝大多数， 但与estothers数据库进行比对后，同源性最高的EST中只有51％来自拟南芥。 说明结球n菜与拟南芥的基因表达模式存在较大差别。这部分相似性较低的序 列，对于研究结球白菜独特的发育和代谢途径以及进行遗传作图具有特殊的意 义。 同源物功能已知部分参照拟南芥研究中的方法，根据其同源蛋白的生物学作 用或生化功能分类，发现参与蛋白质合成的基因数量最多(22．5％)，其次是参 初级代谢(6．6％)、蛋白质修饰和加工储藏(6．4％)等途径的基因。与几种已发 表的双子叶植物叶片EST的功能分类研究比较后发现，在结球白菜结球叶中参 与蛋白质合成过程的蛋白质所占比例最大，而不像其它双子叶植物叶片EST研 究中以参与能量代谢过程的蛋白质占绝对优势。推测这种表达模式的差异可能与 白菜生长环境变化(如低温胁迫)及结球叶的旺盛生长有关。 通过提高反应混合物中引物和dNTP的浓度，对cDNA的全面扩增技术 (PolyAPCR)作了进一步的优化。杂交实验显示，白菜莲座期后期及结球期中 期叶片eDNA的扩增产物保持了起始mRNA的浓度比例关系，可以用于后续杂 交分析。利用载体两端通用引物，对所有挑选出的1438个eDNA克隆的质粒进 膜工具先后共点制了16对尼龙膜，并以标记的eDNA扩增产物作为探针对所有 尼龙膜进行了杂交分析。 分析杂交结果，发现152个杂交点在莲座期与结球中期叶片中表达量上有较 明显差异，其中94个为候选结球期上调表达类型，其余58个为结球期候选下调 表达类型。功能己知部分的候选基因中，表达水平上调部分主要集中于两类反应 途径：一是泛素蛋白／26S蛋白酶体途径，二是低温胁迫抗逆反应途径。推测结球 期植株体内激素水平的改变和外界环境温度的下降可能是导致两类反应途径基 因表达水平改变的主要原因。Northern杂交验证候选基因中的类金属硫蛋白及一 功能未知基因，结果与点杂交一致，即前者在结球期呈现出上调表达模式，而后 者呈现出下调表达模式。同时还获得了类金属硫蛋白基因全长eDNA，Southern 杂交显示桔红心白菜基因组中该基因可能只有一个拷贝。 总之，本研究通过分析结球白菜结球前期叶片的表达序列标签(EST)，构建 了虚拟的结球期叶片基因表达图谱，并采用大规模的点杂交实验研究了结球白菜 结球期叶片的基因表达情况。所获研究成果对于研究结球白菜的结球机理具有重 要的理论指导意义，同时在实践应用上，对于许多具有结球习性蔬菜的分子育种 也必将产生重要影响。 叶，结球白菜(Brassica