抗Bt小菜蛾选育、受体基因克隆PTD对CrylAc增效作用.pdf

摘要 苏云金芽孢杆菌(Bacillus 剂，在世界范围内得到广泛的应用。编码Bt杀虫蛋白的基因也作为最主要的杀虫基因转入到了 科蔬菜的主要害虫，也是最早在田间发现已对Bt产生抗性种群的害虫。本文用Bt制剂和CryIAe 毒蛋白对小菜蛾进行了室内抗性选育研究，并对抗性与敏感小菜蛾种群的相关生物学性状及生物 适合度进行系统分析。在此基础上，完成了抗性和敏感小菜蛾Bt受体蛋白基因的克隆和序列比 对分析，为进一步在基因水平上阐明Bt抗性的分子机理奠定了基础。 蛋白转导结构域(PTD-Protein 体将其它生物大分子携带进入细胞膜内的一段富含精氨酸的多肽。本实验首次将PTD作为载体 携带大分子物质透过细胞膜的特性应用于杀虫蛋白领域，通过PTD与Bt杀虫蛋白融合基因及其 表达载体的构建、融合蛋白的分离纯化和生物活性测定明确了PTD对Bt杀虫蛋白ClylAe的增 效作用和对抗性害虫的克抗作用。主要结果如下： 种群。对抗性与敏感小菜蛾种群的生长发育、存活及繁殖特征的研究表明：抗性种群较敏感种群 产卵量和孵化率下降，幼虫发育历期延长．雌雄比显著降低，雌成虫数量、寿命减少。小菜蛾对 Bt和CIyIAe抗性的产生以牺牲相对适合度为代价，抗性种群在繁殖能力上存在明显的生存劣势。 的核苷酸及推导的氨基酸序列。结果表明，抗Bt种群的APN2与敏感种群有差别的氨基酸突变 多聚酶链式反应(R：H，cR)对小菜蛾的类钙粘蛋白基因eDNA片段进行了克隆和序列分析。通过简 与其它昆虫类钙粘蛋白基因序列具有较高的同源性。 PTD和17个氨基酸Rex,PTD核苷酸双链， 按PTD．CrylAe-6His顺序，合成11个氨基酸Tat 成功设计构建了PTD-CryIAe融合表达载体。对构建的融合表达载体进行诱导、表达和纯化，以 的增效作用，特别是对抗性种群，带有Tat和Rev转导肽的融合蛋白杀虫活性明显增强。对敏感 小菜蛾种群，Tat和Rev的增效倍数分别为4．84、1．29倍；对抗性小菜蛾种群，增效倍数分别为 9．69、4．99倍。该项目在国际上首次将PTD应用于农业研究领域，并证实PTD对微生物杀虫剂 具有显著的增效作用并对抗性小菜蛾具有明显的克抗作用。开辟了PTD应用的新领域并为克服 害虫抗药性提出了新途径。 Bt抗性氨基肽酶类钙粘蛋白蛋白转导结构域 关键词：小菜蛾苏云金芽孢杆菌CryIAc Abstract The insecticide Bacillus areof environmentallyfriendly crystalproteins producedby thuringiensis scientificinterestbecauseoftheir and toawide iusect great potencyspecificity of pests．Because range of toxins their offertremendousbenefitsforinsect higllly toxicity，Bt specific pestmanagement．The selection showthat canalso tO BttOxins．So laboratoryexperimentsmanypests adapt far,documented cases in ofresistancetoBt of arelimi