绿色木霉α-1，2-甘露糖苷酶在毕赤酵母中克隆表达活性检定.pdf

绿色木霉洳1，2-甘露糖苷酶在毕赤酵母中的克隆表达与活性检定 目录 缩略词表 第lIl页 绿色木霉出I，2-甘露糖苷酶在毕赤酵母_．h的克隆表达与活性检定 摘婴 绿色木霉旺．1．2．甘露糖苷酶在毕赤酵母中的 克隆表达与活性检定 摘 要 毕赤酵母是现在广泛应用的、重要的外源基冈表达宿主。本研究是我室毕赤酵母 1二程菌糖基化功能改造T作的起始部分，目的是通过引入绿色木霉的cc．1，2．甘露糖 苷酶以削减酵母宿主表达外源糖蛋白N．糖链甘露糖苷数目。 变成A，以除去自身xhoI位点，加上内质网定位标签HDEL序列将该基浏克隆至酵 5载体上，构 连着Ⅱ．交配蚓子前导肽序列的mds切下来，连接到经同样酶切的pA081 建成pA0815．Ⅱ．M重组质粒。选取第80位氨基酸仅有一个N．糖基化位点的人p—IFN 作为报告蛋白。以含有该蛋白基凶的pUcl9．B质粒为模版扩增出p—IFN基因，酶切后 连接到pA081 pA081 的毕赤酵母工程菌，前者命名为PPMBl，后者为PPMGl。分别培养诱导两种T程菌， 胞活性测定实验表明PPMBl菌中p—IFN活性为3．6 x】05u／!n B1和PPMG】 J。采用从凝胶中直接切取蛋白条带回收的方法从胶中获取PPM 表达的0．IFN，经飞行质谱分别榆测其分子量。通过绿色木霉a一1，2一甘露糖苷酶在毕 赤酵母中对报告蛋白B．IFN分子量产生的影响推测甘露糖残基变化数目。结果表明绿 色木霉Ⅱ．1，2．甘露糖苷酶在毕赤酵母中有活性显示。 关键词：*1，2一甘露糖苷酶；D—IFN；克隆表达：毕赤酵母宿主； 堡垦查篓竺!：：兰堕壁塑蔓墼垄兰查登兰空塑塞堕圭垄皇适堡垫塞 塑墨 and of in Expression actiVi姆assay Pichia yeast Abstract Pichia isone expressionsystem ofthemost used for frequentIy expressionsystems isthe of foreignproteins．This the producing study beginningyeastN-91ycosylati。n inour project Iab．we tointmduceaZ胛esef engineering pIanned d-1，2．mannosidase and it the 10calizeinto yeast reducedthe ofthe endoplasmic