新型隐球酵母关键酶的胞内定位.pdf

摘要 摘 要 新型隐球酵母(Cryptococcusneoformans)是产荚膜担子茵，主要通过鸟的 粪便，土壤腐生物等在自然界传播，经过呼吸道，感染有免疫缺陷的病人，如： 艾滋病患者，器官移植后接受免疫抑制治疗的患者和接受大量固醇药物治疗的 人群，并导致脑膜炎等中枢神经系统疾病，严重者危及生命。目前为止，普遍 认为新型隐球酵母致病性主要与以下三个因素有关：宿主体温37℃条件下生长 的能力；合成多糖荚膜以及产生多酚氧化酶一漆酶。 Fluorescem 绿色荧光蛋白(Green Protein，GFP)是一种独特的报告蛋白 (Reporterprotein)。它稳定、灵敏度高、无生物毒性、荧光反应不需要任何外源 反应底物及表达无物种或细胞组织的专一性，可广泛用于基因的表达与调控、蛋 白质的定位、转移及相互作用、信号传递、转染与转化，以及细胞的分离与纯 化等研究领域。因此，本试验采用构建融合蛋白的方法进行新型隐球酵母中某 些致病性相关基因的细胞定位。 三羧酸循环(TcA)是酵母细胞产生能量的重要代谢途径，其主要功能是 产生能源分子ATP和细胞物质代谢的众多分子前体，对于维持酵母生存及其他 生命活动至关重要。柠檬酸合成酶(Citrate Synthase，Cit)则是该反应中的限速 酶，催化乙酰一CoA和草酰乙酸反应合成柠檬酸，是三羧酸循环的重要调节点， 直接影响三羧酸循环的进行。本实验构建了柠檬酸合成酶缺失菌株Z1cit的互补 度葡萄糖培养基(4％Asn+NE)上培养时其漆酶表达量与野生型一致；在不同的 碳源培养基YEPD、YPG、YPE、蔗糖上培养时各个表型均恢复到与野生型相同 的程度；在高温(37℃)及高碱(PH=8．O)的条件下均可以生长。之后对厶cit：： CIT-GFP进行线粒体染色，并利用共聚焦荧光显微镜对柠檬酸合成酶在新型隐 球酵母中的定位进行观察检测，发现Cit蛋白在线粒体中发挥功能。 RNA RNA依赖的RNA合成酶(RNA．dependent 用是以单链RNA(ssRNA)为模板，在有引物或者没有引物的条件下合成双链 RNA(dsRNA)。RDRP在RNA干扰(IⅢA 的作用。本实验构建RDRP．GFP融合蛋白的表达载体，并将其转入H99中构建 摘要 含RDRP．GFP融合蛋白表达载体的菌株H99，并对该菌株进行表型检测，用DAPI 对细胞核进行染色后利用共聚焦荧光显微镜观察，发现RNA依赖的RNA聚合 酶在细胞核中发挥功能。 关键词： 新型隐球酵母绿色荧光蛋白柠檬酸合成酶RNA依赖的RNA聚 合酶定位 II Abstract lhebasidiomyceteous is yeast,Cryptococcusa neoformans pathogenicfungus which existsinthe environmentand widely infects via immuno．compromisedpeople tract．Thecasenumber respiratory of infectionhasbeen cryptococcal climbing．nle