H9N2亚型禽流感病毒与鸭坦布苏病毒生物学特性地研究及疫苗初步研制.pdf

摘 要 H9N2 亚型禽流感病毒在全世界流行广泛，危害巨大。通常该亚型禽流感病毒为 低致病性，感染禽类后不会引起大批死亡。但最近发现感染该亚型病毒的禽类死亡率 很高，应用多聚酶链式反应（PCR）方法诊断，发现感染本病禽类脏器中同时存在H9N2 亚型禽流感病毒和新发现的鸭坦布苏病毒。基于此问题，本研究分别对H9N2 亚型禽 流感病毒和鸭坦布苏病毒的生物学特性进行了深入研究，并对预防这两种病毒的疫苗 进行了初步探讨研究。 为掌握我国H9N2 亚型禽流感病毒流行株的生物学特性，本研究选取2003～2010 年分离到的27 株病毒进行了系统深入的研究。遗传演化分析发现我国H9N2 亚型禽流 感病毒的遗传演化复杂，部分毒株PA 和NS 基因与H9N2 亚型禽流感病毒参考序列的 同源性均不高，表明这些基因可能来源于其它亚型的流感毒株，序列分析发现 H9N2 亚型禽流感病毒近期分离株的基因片段主要起源于 Ck/Shanghai/F/98 (H9N2)株。交 叉血凝抑制实验及病毒中和实验表明近年来我国H9N2 亚型禽流感病毒的抗原性发生 了明显的改变。对BALB/c 小鼠致病性实验说明我国H9N2 亚型禽流感病毒对小鼠的致 病能力呈现下降趋势，尤其是2006 年后的病毒分离株在小鼠体内的复制能力明显低 于早期分离株。挑取处在不同进化分支的4 株H9N2 亚型禽流感病毒对4 周龄SPF 鸡 进行了鼻腔接种致病性实验，发现这些毒株主要在感染鸡的气管和肺脏中增殖，但不 出现明显症状。 根据上述抗原性分析结果，从 H9N2 亚型禽流感病毒分离株中筛选出一株病毒 Ck/Shanghai/441/09 （H9N2）（简称Ck441）进行了初步的疫苗（免疫学）研究。Ck441 病毒尿囊液灭活后制备灭活（毒株）疫苗，免疫4 周龄SPF 鸡，免疫3 周后，用Ck441 和一株2011 年H9N2 亚型禽流感病毒分离株进行攻毒实验，发现免疫组鸡均不发病、 不排毒，而对照组鸡 100%排毒，表明 Ck441 是一株理想的疫苗候选株。为提高病毒 株的在细胞上的增殖能力，把Ck441 的HA 和NA 插入到pBD 载体SapI 酶切位点之间， 分别拯救获得了4 株重组病毒，通过鸡胚和细胞增殖实验，发现441HANA/PR8-mutNS 在鸡胚和细胞上增殖滴度都很高，将该株病毒经鸡胚和细胞扩增、灭活后制备灭活疫 苗并免疫SPF 鸡，都能够达到100%的保护率。 鸭坦布苏病毒是2010 年4 月以来引起鸭产蛋量下降、生长阻滞甚至死亡的新发 鸭传染性疾病的病原，为获得此病毒对哺乳动物和鸡的致病信息，将鸭坦布苏病毒奉 贤分离株（FX2010）人工感染BALB/c 小鼠和SPF 鸡。经肌肉和腹腔注射接种小鼠， 各组织脏器均没检测到病毒；经鼻腔接种小鼠，FX2010 病毒可在BALB/c 小鼠的肺脏 中复制增殖；脑内接种，BALB/c 小鼠出现明显的临床症状，被毛逆立，体重下降， 在小鼠的脑和肺脏中均可分离到病毒，随着接种病毒量的增加，小鼠体重下降更加明 显；经8d 后，脑内病毒含量仍然很高，而肺脏中的病毒含量明显降低。FX2010 经肌 肉和鼻腔接种2 周龄SPF 鸡，经鼻腔接种鸡体重增长明显减缓，肌肉接种体重变化与 对照组无明显差异。病毒分离发现，经鼻腔和肌肉接毒的鸡在多个脏器均可分离到病 毒；FX2010 病毒经鼻腔接 SPF 产蛋鸡，实验组鸡排出绿色粪便，产蛋量呈现一过性 下降，部分脏器能够检测到病毒。在感染鸡的整个实验过程中，未见鸡严重发病或死 亡，表明该病毒对鸡呈现低致病性。 为初步研制防控鸭坦布苏病毒病的DNA 疫苗，将鸭坦布苏病毒E 基因和密码子优 化后E 基因分别插入到真核表达载体pCAGGS，通过IFA 和Western blot 实验，证明 两种重组质粒在真核细胞内都能表达具有免疫原性的E 蛋白，而优化后的重组质粒较 野生型的表达量更高。重组疫苗 （毒株）质粒免疫小鼠后，用间接 ELISA 检测两种 DNA 疫苗免疫小鼠的血清抗体，发现密码子优化后E 基因的质粒激发的抗体效价高于 未优化质粒，该试验为DNA 疫苗防治鸭坦布苏病毒病提供了初步研究数据。 总之，本研究阐明了H9N2 亚型禽流感病毒和鸭坦布苏病毒的部分生物学特性， 初步研制了H9N2 亚型禽流感的灭活疫苗和鸭坦布苏病毒病的DNA 疫苗质粒。这些研 究为H9N2 亚型禽流感病毒病和鸭坦布苏病毒病的防治提供坚实的理论依据。 关键词：禽流感病毒；H9N2 亚型；鸭坦布苏病毒；生物学特