柠条锦鸡儿组织培养体系的建立及肉桂醇脱氢酶基因的克隆和生物信息学分析.pdf

摘 要 柠条锦鸡儿(Caragana korshinskii Kom) 是广泛分布于内蒙古地区的一种多年生 灌木，具有极强的抗逆性，可以抗寒、抗热、抗旱、抗盐碱，是防风固沙的优良树种， 家畜的优良饲料，具有很高的经济效益。过去对柠条锦鸡儿的研究多集中在生理生态 方面，而如今其品质改良、分子方面的研究愈来愈受到人们的重视，使得柠条锦鸡儿 的组织培养与遗传转化成为限制进一步研究利用柠条锦鸡儿的重要因素。 木质素是细胞壁中仅次于纤维素的一种重要成分，对植物具有增加机械强度、运 输水分及抵御外界不良环境的重要作用，对人类的生产、生活也有着重要的影响。肉 桂醇脱氢酶(CAD)在三种木质素合成过程中均起到重要作用，可以催化肉桂醛转化为 相应的肉桂醇。因此，对木质素合成基因CAD 的研究非常重要。 本研究以柠条锦鸡儿子叶节为外植体，经过器官再生途径产生再生植株，初步建 立了柠条锦鸡儿的组织培养体系，为柠条锦鸡儿遗传转化体系的建立奠定基础。根据 已报道植物的木质素合成基因CAD 的保守区设计简并引物，并结合RT-PCR 及RACE 技术，首次克隆到柠条锦鸡儿CAD 基因的cDNA 全长序列及基因组DNA (gDNA) 全 长序列，并将cDNA 全长序列命名为CkCAD (GenBank 登录号为HQ829861) ，并对 其进行生物信息学分析。主要研究结果如下： 1. 对柠条锦鸡儿野生种子采用 75% 乙醇预处理 10min，再用 10% NaClO 处理 40min 的方法进行表面消毒，其污染率低，且不影响幼苗的生长。 2. 以柠条锦鸡儿无菌苗子叶、胚轴为外植体诱导愈伤组织，发现在MS+0.5mg/L 6-BA+2mg/L 2,4-D 培养基上可诱导大量的愈伤组织，在增殖培养基 MS+0.5mg/L 6-BA+0.5mg/L 2,4-D 中长势良好，但难以分化成芽。 3. 以柠条锦鸡儿无菌苗子叶节为外植体，通过设计三因素四水平正交试验筛选 出最佳芽诱导条件为，在B5 培养基上萌发6 天的子叶节芽诱导效率最高；优化后丛 生芽诱导条件为，6-BA 浓度为2.0mg/L 时丛生芽长势良好，多数长丛生芽的外植体 有2 个芽，其次为3-5 个芽，少数有8 个芽。 4. 将丛生芽切下进行生根实验，通过进行三因素四水平正交试验筛选得到最佳 生根条件为：1/8MS+0.5mg/L IBA+0.5mg/L NAA ，最高生根率为66.67%，一个幼苗 平均可生出2.91 条根。 5. 生根后的幼苗在水中炼苗后，移栽到蛭石：营养土=1:1 的基质中，三周后幼 苗的成活率为93.22% 。 6. CkCAD 序列长度为1,287bp ，具备长度为1,074bp 的完整阅读框，起始密码子 为ATG ，终止密码子为TGA 。此外，该序列还有95bp 的5′调控区、118bp 的3′非编 码区和polyA( 11)尾巴。预测其编码的蛋白质含357 个氨基酸，等电点为5.44，相对 分子质量为38.75 kD，二级结构主要由α-螺旋，β-折叠和无规则卷曲组成，并对其 三级结构进行了预测。系统进化分析发现，CkCAD 与豆科植物紫花苜蓿CAD2 和银 合欢CAD 的亲缘关系最近。 7. 柠条锦鸡儿CAD 基因的gDNA 全长为2,016bp，具有五个外显子和四个内含 子。内含子左侧边界均为GT，右侧边界均为AG ，符合真核生物内含子的结构特点。 8. 构建了柠条锦鸡儿 CAD 基因的过表达载体 35S::CAD，并转化野生型拟南芥 (Col-0) ，卡那霉素抗性筛选后已经获得T3 代纯合体植株。 关键词：柠条锦鸡儿；丛生芽；肉桂醇脱氢酶；生物信息学分析 Establishment of the Regeneration System of Caragana korshinskii Kom and Cloning and Bioinformatics Analysis of Its Cinnamyl Alcohol Dehydrogenase Gene