神经管缺损诊断项目简介.docVIP

鉴别胆碱酯酶亚型的寡配体试剂盒 中国科学院孙曼霁院士 项目名称： 《鉴别胆碱酯酶亚型的寡配体试剂盒》 二、立项背景 1、神经管缺损的发生 神经管缺陷症(Neural tube defects，NTDs)是胚胎在妊娠第24～28天期间因神经管闭合受阻所致的一系列严重畸形，是我国高危、高发畸形之一，也是围产儿死亡和致残的主要原因，约占我国先天畸形的20%～25%。神经管缺损儿出生素质差，围产期病死率高，预后不良。加强预防和产前诊断是降低发生率的有效措施。 2、神经管缺损诊断方法 1）现有的诊断方法 （1）B超检查法； （2）母血及羊水甲胎蛋白（AFP）检查法； （3）羊水AChE酶活性检测：正常羊水不含AChE，神经管缺陷胎儿的脊髓和脑组织暴露在羊水中时，羊水中则出现AChE，但羊膜穿刺时可能由于血样污染导致假阳性，所以NTD产前诊断迫切需要能区分突触型和红细胞型AChE的试剂。AChE的检测是神经管缺损的最特异性指标。 （4）绒毛膜AChE检测； （5）其他辅助诊断的方法：人绒毛膜促性激素β亚基、游离雌三醇、妊娠相关血浆蛋白的检测。 2）各种方法的优缺点和比较 （1）甲胎蛋白的检测 母血及羊水甲胎蛋白（AFP）NTD产前诊断能区分突触型和红细胞型AChE，用抗人突触型AChE多克隆或单克隆抗体检测羊水中异常存在的突触型AChE，可以提高诊断的特异性，避免因羊膜穿刺时可能的血样污染而出现的假阳性。 （5） 其他 血清人绒毛膜促性激素β亚基(β-HCG)、游离雌三醇(E3)、妊娠相关血浆蛋白(PAPP—A)检测：一般认为人绒毛膜促性激素β亚基(β-HCG)、游离雌三醇(E3)主要在孕中期有筛查意义，血E30.7mmol/L为异常，妊娠相关血浆蛋白(PAPP-A)在妊娠早、中期均明显降低，因此这些血清标记物可在妊娠中期辅助AFP的检查，作为筛查胎儿NTDs异常的主要指标，亦可对胎儿染色体异常进行筛选。但血清标记物并不是一项直接诊断NTDs的依据。 突触型AChE寡配体检测法 本项目发明了能区分突触型与红细胞型AChE及丁酰胆碱酯酶的寡配体，并将之应用于神经管缺损的诊断。 三、 本发明的目的 针对胎儿神经管缺陷症市售诊断试剂的缺点及临床早期诊断的需要，本发明推出拥有自主知识产权的新型寡配体试剂盒。用于严格区分神经型与红细胞型AChE及丁酰胆碱酯酶，作为NTD产前检查及实验室研究之工具。 四、 此项目的优势和原创性 本项目所发明的突触型AChE寡核苷酸寡配体特异性地与人源突触型AChE结合，而不与人源红细胞型AChE及人源丁酰胆碱酯酶结合，完全避免了穿刺获取羊水时可能造成的血液污染的干扰，避免了由此 产生的假阳性结果的出现，提高了NTDs的确诊率。 抗人源性突触型AChE的特异性脱氧核苷酸寡配体（简称寡配体）用于突触型AChE特异性鉴别的构思新颖，有原创性。 此寡配体特异性地与人源性突触型AChE反应，而不与人源性红细胞型及人源性丁酰胆碱酯酶反应，为国内外独创。 此寡配体可大量合成、易于生产、纯度高、成本低、稳定性好、可常温下运输、长期保存。 根据实验需要还可连接巯基、氨基、荧光素、酶等功能基因，扩大延伸其用途。 五、国内外研究状况 目前还未见到能有效区分神经型和红细胞膜型AChE的特异性试剂盒上市。 六、实验研究 1、免疫印迹（western blotting） 将人脑匀浆、纯化的人红细胞AChE及人全血样品进行SDS，转膜后与生物素化寡配体HRP显色。实验结果显示，寡配体AChE特异性地结合，在66 kD处呈现一条带（ 图1泳道B），而与纯化人红细胞AChE（图1泳道A）及人全血（图1 泳道C）无结合。说明寡配体AChE和人红细胞型AChE。 图1寡核苷酸适配体的免疫共沉淀。A) 纯化人红细胞AChE; B) 人脑匀浆；C) 人全血；D)纯化的人脑AChE 2、点杂交 将胆碱酯酶点样于NC膜上，封闭后，然后加入生物素化单克隆寡配体，再用链亲和素连接的HRP显色。结果表明寡核苷酸寡配体AChE和电鳐AChE显示特异性结合，而与人及牛红细胞AChE及人BChE无结合能力（表 1）。 表 1. 单克隆寡核苷酸寡配体和不同来源的纯化胆碱酯酶的点杂交 来源 天然酶 变性酶 人脑 AChE 人红细胞 AChE 人BChE + - - + - - 3、酶蛋白结合测定（ECA） 链亲和素包板，BSA封闭后，生物素化单克隆寡核苷酸配体AChE和底物显色液，在414 nm波长处测定消光值。 ECA显示针对人脑AChE的寡配体AChE显示明显的特异性结合反应，而与人红细胞AChE及人BChE无结合现象（图2）。进一步说明了寡配体AChE的特异性。 图 2. 寡配体和不同来源的纯化的胆碱酯酶的酶蛋白结合测定。 (■)，人脑AChE; (○)， 人红